2020 Fiscal Year Research-status Report

酸化リン脂質依存的細胞死抑制因子SMS2の生理的機能の解明

Research Project

Project/Area Number	19K07050
Research Institution	Kitasato University
Principal Investigator	熊谷剛北里大学, 薬学部, 講師 (30365184)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2023-03-31
Keywords	脂質の酸化 / 細胞死 / スフィンゴ脂質 / フェロトーシス
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、GPx4欠損により誘導される酸化リン脂質依存的な細胞死（リポキシトーシス）に対するSMS2の酸化リン脂質代謝活性を介した抑制機構の解明と生体における機能を実証する事を目的とし、本年度は、以下の２点の解析を中心に研究を行なった。 1)DAGOOHの代謝経路の解明 SMS2の過剰発現は、GPx4欠損により生じるPCOOHをceramideとDAGOOHに代謝することでリポキシトーシスを抑制していると予想されるが、その後DAGOOHがどのような経路で代謝されるのかは不明である。DAG代謝酵素の阻害剤を用いて検討したところ、DAGアシルトランスフェラーゼおよびDAGリパーゼが、リポキシトーシスの抑制に機能していることが示唆された。そこでどの分子が重要なのかさらに詳細に解析するために、各代謝酵素の発現およびリポキシトーシスにおける発現の変動を確認した結果、４つの分子が候補として考えられた。現在、CRISPR/Cas9システムを用いてそれぞれの遺伝子破壊した細胞株を作製し、リポキシトーシスに対する影響を検討している。 2)肝臓特異的GPx4/SMS2二重欠損マウスを用いたSMS2の酸化脂質代謝活性の実証 In vitroで明らかとなったSMS2の酸化脂質代謝活性が、in vivoでも発揮されるのかを明らかとするために、肝臓特異的GPx4/SMS2二重欠損マウスを作製した。我々は、これまでに肝臓特異的GPx4欠損マウスをビタミンE添加食下で飼育した後、ビタミンE欠損食に変更すると変更後3ヶ月～５ヶ月で酸化脂質依存的に死亡することを明らかとしている。そこでこの致死に至る期間を肝臓特異的GPx4欠損マウスと肝臓特異的GPx4/SMS2二重欠損マウスで比較した。その結果、わずかではあるが、GPx4単独欠損マウスより二重欠損マウスの方が生存期間の中央値が短かった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究は４カ年計画で大きく５つの解析を行う予定である。そのうち初年度・二年度では3つの解析で結果を得ることができた。残りの2つについても並行して準備および予備的な実験を進めており、残りの２年間で当初の目的の大部分は達成できると考えられる。
Strategy for Future Research Activity	DAGOOHの代謝経路について、阻害剤を用いた解析より関与する経路および候補分子の絞り込みを行い、これらの分子をCRISPR/Cas9システムを用いて欠損させた細胞の構築を行っている。欠損細胞が作製でき次第、リポキシトーシスに対する影響を検討して、どの分子が重要なのかを明らかにする。一方、生体内でのSMS2の酸化脂質代謝活性を実証するため肝臓特異的GPx4/SMS2二重欠損マウスを用いて解析を行なった。その結果、わずかであるが、SMS2が欠損することでビタミンE欠乏食により引き起こされる酸化脂質依存的な個体致死に至る期間の短縮が認められた。この結果をより明確に示すために、より肝臓にシビアなストレスを負荷する実験モデル系を用いて解析を行う予定である。具体的にはコリン欠乏高脂肪食による脂肪肝モデル、また肝臓に酸化ストレスを誘導し障害を与える四塩化炭素投与モデルを用いて、SMS2のin vivoでの抗酸化活性の実証を試みる予定である。