2019 Fiscal Year Research-status Report
Oxidatively modified high-density lipoprotein: its roles in vessel wall tissues and mechanism of its generation.
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19K07051
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| Research Institution | Showa University |
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Principal Investigator |
板部 洋之 昭和大学, 薬学部, 教授 (30203079)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
澤田 直子 (笹部直子) 昭和大学, 薬学部, 助教 (50643566)
小濱 孝士 昭和大学, 薬学部, 准教授 (60395647)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 酸化LDL / 酸化HDL / 動脈硬化症 / 急性心筋梗塞 / LC-MS/MS |
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| Outline of Annual Research Achievements |
酸化的変性を受けた低比重リポタンパク質（oxLDL）が動脈硬化症の発症要因であることが知られてきた。当研究室でこれまでヒト血漿中から分離したoxLDLの解析結果から、血漿LDL中のoxLDLは陰性荷電の違いで少なくとも2つのタイプが存在することが分かった。特に、陰性荷電に富むoxLDL画分はoxHDLを伴っており、何らかの複合体様の粒子を形成している可能性を見出した。この画分は、急性心筋梗塞患者の急性期血液で健常者よりも有意に増加していることから、破綻した粥状動脈硬化プラークから漏出してきたものと推察される。このような酸化変性リポタンパク質粒子の性状と形成過程を明らかにするのが、本研究の目的である。
ヒト血漿LDL中の陰性荷電に富む画分を分離し、電子顕微鏡で観察したところ、LDL様の直径約23～25nmの粒子に加えて、HDL様の直径約11～13nmの粒子が多数存在した。この画分をアガロース電気泳動すると2つのバンドが検出され、ウエスタンブロットおよびLC-MS/MSにより、ApoB-100とApoA-1が確かめられた。この画分中のoxLDLとoxHDLが共有結合で架橋している可能性を検討するため、人工的に架橋したLDL-HDL粒子を作成し、これの複合体に対するサンドイッチELISA系を構築した。サンドイッチELISAおよびウエスタンブロットの結果、ヒト血漿中の陰性荷電に富むLDL画分中に共有結合的に架橋したLDL-HDL粒子は見出せなかった。これらの検討から、陰性荷電に富むoxLDL画分中の複合体の存在状態について、一定の見解を得た。
また、ここまでの一連の成果をまとめ、論文に公表した。（Sawada N, et al. J. Lipid Res. 2020, e-pub ahead of print）
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
LDLから分離した陰性荷電に富む画分中の粒子をネガティブ染色で電子顕微鏡観察し、陰性荷電画分に回収された粒子の直径の分布を明らかにした。LDLサイズの粒子（16～31nm）とHDLサイズの粒子（8～16nm）が共存しており、LDLサイズの範囲を超えた大きな粒子は見つからなかった。多数の粒子が集まった凝集体は存在せず、多くのものは孤立した粒子であったが、一部にLDLとHDLが接したものが確認できた。
陰性荷電に富むLDL画分をアガロース電気泳動すると、2つのバンドが検出される。ウエスタンブロットおよびLC-MS/MSにより、これらのバンドには主にApoB-100とApoA-1が認められ、LDLとHDLの存在が確かめられた。
この画分中のoxLDLとoxHDLが共有結合で架橋している可能性を検討するため、人工的に架橋したLDL-HDL粒子を作成し、この複合体に対するサンドイッチELISA系を構築した。Cys残基のSH基およびLys残基等のNH2基に結合するヘテロ二価クロスリンカーのsulfo-SMCCを用いてLDL-HDL架橋粒子を作成した。ヒツジ抗ヒトapoB-100抗体と西洋ワサビペルキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトapoA-1抗体を組合せたサンドイッチELISA系で、30ng/wellのLDL-HDL架橋粒子が選択的に検出できた。しかし、この測定系ではヒト血漿LDL中の陰性荷電に富む画分中の複合体粒子は検出できなかった。
これらの結果を総合して、ヒト血漿中のoxLDLとoxHDLの相互作用は、共有結合で架橋した複合体形成は限定的で、おもに静電的相互作用によるものと結論した。
また、ここまでの一連の成果を論文としててまとめ、この分野で評価の高いJournalに公表できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和2年度は、HDLを種々の条件で酸化した時の酸化修飾の構造の調べ、さらにHDLとLDLの共存下での酸化修飾とも比較する。酸化修飾が起こる際のHDLとLDLの相互作用の可能性について、基盤となる知見を得たい。令和元年度に、LC-MS/MSの解析の幅を広げるためSWATHシステムを導入した。SWATHシステムはデータ非依存的MS/MS解析を行うため、分析に供したサンプル中のすべてのイオンのデータを集積し、訂正および定量的な解析をすることができる。種々の異なる構造の産物が生じる酸化リポタンパク質粒子の解析に有用となることが期待できる。iTRAQ法と合わせて活用していく。
ヒト血漿から分離できる in vivo酸化LDLの回収量がわずかであるため、培養細胞への添加実験を行う十分な量が得られない可能性がある。試験管内の反応で、in vivo酸化LDLのより良いモデルとなるoxLDL-oxHDL複合体の作成を試みるが、単純な架橋粒子ではないことが分かり、当初想定していたよりも難しいかもしれない。その場合、培養系の実験条件を工夫して、スケールダウンを試み、血漿から分離した画分そのものでの評価を試みる。
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| Causes of Carryover |
令和元年度に購入した消耗品が予想より少し安価だったため1050円の残額が生じた。少額ではあるが、目的に沿った有効利用に努めるため、繰り越して次年度の研究費と併せて物品費（試薬等の消耗品）として使用させて頂きたい。
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