ゲノム安定性維持機構の破綻による男性不妊の分子メカニズムの解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07053
• Research Institution: Tokyo University of Pharmacy and Life Science
• Principal Investigator: 松下 暢子 東京薬科大学, 生命科学部, 准教授 (30333222)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: DNA損傷修復 / 精巣

Outline of Annual Research Achievements

大気汚染などの環境の変化やライフスタイルの変化によって精子の機能低下がおこり、男性不妊の主要な原因となるが、この精子の機能低下の原因の一つが精子DNAの損傷であることが近年明らかにされている。環境やライフスタイルの変化は細胞に様々なエピジェネティックな変化をもたらすが、精巣でのDNA損傷後におこる修復応答においてエピゲノム制御因子がどのような機能を行なっているのか詳細は未だ解明されていない。
そのため本研究では、エピゲノム制御因子の精巣における役割を解明し、エピゲノム情報の再構築によるDNA損傷修復反応の精巣特異的な分子基盤を明らかにすることを目指している。さらに、放射線や抗がん剤などでのDNA損傷による男性不妊マウスモデルを用いて精子形成におけるエピゲノム制御因子の機能の解明を目的としている。
これまでに放射線照射によるDNAの切断により、Ataxia telangiectasia-mutated (ATM) キナーゼ依存的に転写が活性化されるエピゲノム制御因子を明らかにしてきた。さらに、そのエピゲノム制御因子のプロモーター領域を既に明らかにしており、この部位をルシフェラーゼ遺伝子の上流に導入したレポーターコンストラクトを作製し、ルシフェラーゼベースのレポーターアッセイを行なってきた。その結果として、現在までエピゲノム制御因子の発現調節部位の配列から予測される複数の転写因子のsiRNAを用いてレポーターアッセイを行い、転写を制御する複数の因子をすでに同定した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では、環境やライフスタイルの変化が細胞にエピジェネティックな変化をもたらすのと同様に、精巣において環境やライフスタイルの変化によって引き起こされるDNA損傷に対する修復応答にもエピゲノム制御因子が重要な役割を果たしていることを明らかにすることを目指している。そのためには精巣において、放射線や抗がん剤などでのDNA損傷によって転写が活性化されるなどの変化がみられるエピゲノム制御因子を明らかにして、その機能とその転写制御機構を解明することが必要である。さらに、新たに獲得したエピゲノム情報を再構築することによってDNA損傷修復反応の制御機構を解明することが必要である。
これまで、放射線照射や抗がん剤によってひきおこされるDNA損傷により、精巣において転写が活性化されるエピゲノム制御因子を明らかにしている。さらにその転写を制御する複数の因子を同定している。また、すでにCRISPR-Cas9システムを用いてHeLa細胞において、この同定されたエピゲノム制御因子を欠損させた細胞と、その欠損細胞にエピゲノム制御因子遺伝子を恒常的に発現させた細胞を作製している。現在これらの細胞において、DNA損傷修復反応にどのような変化が認められているのかについて生化学的な解析を行っている。さらにこれらの細胞を用いて、放射線照射によるDNA二重鎖切断損傷後における、ヒストンやそのほかのクロマチンタンパク質群の翻訳後修飾を網羅的に解析し比較検討を行っている。

Strategy for Future Research Activity

本研究はエピゲノム情報の再構築によるDNA損傷修復反応の精巣特異的な分子基盤を明らかにし、その分子メカニズムを解明することを目的としている。
これまでに精巣において、DNA損傷後において転写が活性化されるエピゲノム制御因子をすでに同定しており、現在解析行っている。そのため今後は、このエピゲノム制御因子による遺伝子発現制御機構の網羅的解析を行う。まず、次世代シーケンサーによるRNAシーケンス解析を用い、DNA二重鎖切断後のエピゲノム制御因子発現細胞と欠損細胞における既知の転写産物の発現定量化と配列から新規転写産物や新規スプライスジャンクションを網羅的に探索し、微量転写産物についても比較検討する。さらにDNA二重鎖切断後における、エピゲノム制御因子のゲノム上の特異な部位への結合についてゲノムクロマチン免疫沈降シーケンスを行い調べる。
次にDNA損傷薬剤によるマウスでの精子形成と不妊への影響とエピゲノム制御因子の機能の解析を行う。精巣での減数分裂時のDNA損傷修復反応におけるエピゲノム制御因子の影響を、マウスを用いて解析する。マウスの精巣にエピゲノム制御因子を標的とするsiRNAを直接注入した発現抑制群とコントロールsiRNAを注入したコントロール群を作製する。次に、すでに精巣での精子へのDNA損傷の影響が報告されている放射線照射、あるいは抗がん剤のシスプラチン、ドキソルビシンの腹腔投与を行う。１週間後にマウスの精巣の組織学的解析を行い、精細管の構造や精祖細胞から精子への分化能をsiRNAによるエピゲノム制御因子の発現の有無による影響を検証する。さらに精巣組織を採取し遺伝子解析を行うとともに、精子の運動能力や生化学的解析を行っていく予定である。