NASH発症過程における生体内一重項酸素の機能解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07057
• Research Institution: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• Principal Investigator: 室冨 和俊 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (40635281)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 一重項酸素 / 酸化ストレス / 活性酸素種 / NASH

Outline of Annual Research Achievements

本研究では生体内あるいは細胞内における一重項酸素の機能を探求し、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）等の疾患発症に一重項酸素が関与するのか、という仮説を検証する。
令和元年度は、半減期が極めて短い一重項酸素を細胞内で安定して測定する方法を検証した。ミトコンドリアに集積する一重項酸素検出プローブSi-DMAおよび熱分解により一重項酸素を発生するエンドパーオキシド（EP)を用い、FACSおよびタイムラプスイメージングで蛍光強度を測定した。その結果、いずれの方法でもEP濃度依存的に蛍光強度が増強し、EP濃度と蛍光強度には相関関係が認められた。培養液や細胞内での一重項酸素の発生や消失は、短時間（数秒以内）に生じると予想されるため、蛍光強度の経時変化を追跡できるタイムラプスイメージングの方が適した実験系だと考え、以降の実験に用いた。同様の測定法を用いて、一重項酸素消去剤アジ化ナトリウムの影響を解析したところ、濃度依存的に蛍光強度は低下した。さらに、in vitroで一重項酸素消去活性が高いと報告されているアスタキサンチンを前処置すると、EP添加後の一重項酸素産生が有意に抑制された。以上の結果、EPとSi-DMAを用いたタイムラプスイメージングにより、安定して細胞内一重項酸素発生量を測定できることが明らかとなった。
次に一重項酸素の細胞への影響を解析するために、一重項酸素発生後の細胞死率を測定した。その結果、0.5mM EP添加によって一過的に細胞死が誘導されたものの、その後細胞増殖が亢進している可能性が示唆された。今後、一重項酸素発生によってどのような細胞応答が生じたか解析するために、網羅的遺伝子発現解析等を実施する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

細胞内一重項酸素測定については、論文投稿にまで至り、当初の計画以上に進展している。一方、培養細胞でNASHを模倣した条件を決定するのに時間を要しているが、一重項酸素の細胞応答解析は計画通り進んでいるため、総じて順調に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

今後は主に以下の３点について研究を進める。
・NASH模倣条件下で、細胞内一重項酸素発生量の経時変化測定
・一重項酸素発生による細胞内遺伝子発現量の変化とその機能解析
・NASHモデルマウスを用いたNASH病態に及ぼす一重項酸素の機能解析

Causes of Carryover

当初予定していたNASH模倣条件下における一重項酸素測定を計画していたが、NASH模倣条件の決定が難航したため、次年度に持ち越すことにした。一方、細胞内一重項酸素の測定は再現性の良いデータを獲得することができたため、繰り上げて研究を進めた。従って、当初より次年度行う予定の実験に加え、翌年分に持ち越す実験を行うため、上記のような所要額となった。