2019 Fiscal Year Research-status Report
好中球細胞外トラップ形成への酸化変性リポタンパク質の寄与と血管炎症誘導機構の解析
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19K07069
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| Research Institution | Showa University |
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Principal Investigator |
小濱 孝士 昭和大学, 薬学部, 准教授 (60395647)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 好中球 / 酸化LDL / リポタンパク質 / 動脈硬化症 / 血管炎症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
好中球細胞外トラップ（neutrophil extracellular traps: NETs）は非感染性の疾患でも見いだされており、動脈硬化や血栓などの血管疾患にも寄与することが知られているが、リポタンパク質との関連についてはいまだ未解明な点が多い。本研究は酸化LDL存在下におけるNETs形成と血管内皮細胞の炎症応答に着目して検討を進めている。
・ヒト末梢血由来好中球を用いた検討：これまで当研究室ではHL-60細胞をAtRA処理で分化誘導して調製した好中球様細胞を用いて、PMA刺激で誘導されるNETs形成が酸化LDL存在下で促進されることを明らかにしてきた。これまで得られた知見がヒト好中球でも観察されるかどうかを確認するために、健常ヒト末梢血から好中球を分離して検討した。ヒト好中球を50nM PMAで刺激すると培地中へのDNA放出が検出され、続く20ug/mL酸化LDLでの刺激により有意に促進された。未変性LDLによる刺激ではNETs形成は促進されなかったことから、HL-60由来好中球と同様の応答を示すことを明らかにした。
・NETsで放出されるプロテアーゼによるリポタンパク質変性の検討：好中球のNETs形成により細胞外に放出されるcathepsinGがLDLタンパク質成分の変性に寄与するか検討した。cathepsinG標品を未変性LDLに作用させると、200kDa未満の多くの断片が生じ、特異的阻害剤（cathepsinG inhibitor I）により抑制された。次に、HL-60由来好中球のNETs形成後の培養上清を未変性LDLに作用させて解析した。阻害剤の有無での比較から、NETs由来のcathepsinGにより生じたと推測される断片が60kDa付近に検出された。またWestern blotによる解析から、生じた断片はapoB-100由来であることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでHL-60由来好中球を用いて明らかにしてきたことがヒト末梢血由来好中球でも同様に観察されることを見出し、論文とミニレビューで報告した。NETsにより細胞外へ放出されるプロテアーゼがリポタンパク質を変性する可能性について、これまではHDL変性への寄与についてのみ報告されていたが、今回の検討からLDL変性にも寄与する可能性を示唆する結果が新たに得られた。
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| Strategy for Future Research Activity |
NETsに含まれるプロテアーゼがLDLのタンパク質成分を分解してLDL変性に寄与する可能性について、さらに詳細な解析を進める。酸化LDLとNETs成分のHAECsへの取込みについて、SYTOX Green染色したNETs-DNAとDiI標識酸化LDLを用いて、HAECsへの取込み量の変化、局在変化、またHAECsの炎症応答との関連について解析する。また酸化LDL受容体の発現抑制、阻害剤の処理、また受容体以外のinternalization関連因子の抑制などの手法を用いて検討を進める。
網羅的定量解析を行うことができる質量分析システム（SWATH法）を昨年導入した。これを活用して、好中球のNETs形成前後、酸化LDL有無におけるタンパク質成分または脂質成分の変動解析を行う。またNETsと酸化LDLで刺激したHAECsでのタンパク質および脂質成分の変動ついても同様に解析を進める。
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| Causes of Carryover |
3月に参加を予定していた学会が中止となり、旅費・宿泊費の支出がキャンセルされたため。翌年度に物品費などで使用する予定である。
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