新規抗真菌薬の創出を目指した病原性真菌の鉄代謝ネットワークの解析

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07072
• Research Institution: Suzuka University of Medical Science
• Principal Investigator: 中山 浩伸 鈴鹿医療科学大学, 薬学部, 教授 (40369989)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 森田 明広 鈴鹿医療科学大学, 薬学部, 助教 (20382228) ; 田口 博明 鈴鹿医療科学大学, 薬学部, 教授 (20549068)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 鉄欠乏ストレス / 真菌感染症 / カンジダ / 病原性発現 / 標的分子

Outline of Annual Research Achievements

鉄欠乏は、感染時に起こる様々なストレスのうち、病原性との関連が強い。そのため、有効な治療法の開発が急務である真菌感染症対策において優れた薬剤標的因子が選出できる可能性がある。本研究は、病原酵母カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）を用いて、鉄欠乏ストレスの応答時に構築される鉄代謝のネットワークの解明から真菌症の治療戦略を創出することを目的としている。
前年度までの実験で、試した欠損株の中で最も病原性が低下した因子CTH2（鉄欠乏時に鉄代謝関連遺伝子の分解に関わる因子）に着目し、その欠損株が、カイコ体内で有意に減少することを明らかにした。次に、CTH2の制御下にある遺伝子群の絞り込みとそれら遺伝子の欠損株を作成し、培地中の鉄濃度が低いと増殖できない株の選抜を行なっているが、該当の株の選抜に至っていない。また、ミトコンドリアおよびバキュオロ活性を蛍光にて測定する系のセットアップを行い、CTH2やその他鉄代謝に関わる転写因子SEF1、鉄取り込みに関わる遺伝子（FET3、FET4、ARN1）の欠損株のミトコンドリアおよびバキュオロ活性に着手している。さらに病原性への関与を調べる実験系として、培養細胞を用いた系のセットアップも開始した。
今年度の成果発表として、Scientific Reports（17;10(1): 9789）に鉄キレーター作用を持つ血清添加培地で感受性が高いelm1欠損株について、形態異常や病原性についての論文を発表した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究期間で、１）トランスクリプトーム解析から鉄代謝調節に関わっていると考えている因子の同定とそれらのネットワーク上で位置付けの決定、2）鉄の代謝調節は、ミトコンドリアとバキュオロの機能が強く関連するため、同定した因子の機能やミトコンドリアやバキュオロとの関連性の解明、3）因子の変異株を用いた真菌感染モデルの実験から抗真菌薬の標的分子としての妥当性を検討、４）変異株を用いた細胞レベルでのスクリーニング系の確立を計画した。
これまでの実験で1)および3）については、候補遺伝子の欠損株を作製、培地中の鉄濃度が低いと増殖できない株を選抜、カイコ感染モデルを用いて病原性への関与の有無を確認し、鉄欠乏時に鉄代謝関連遺伝子の分解に関わる因子CTH2の欠損株の病原性が最も下がり、カイコ体内で生菌数が有意に減少することを明らかにした。また、着手し始めた感染モデルとして培養細胞を用いた実験系の完成を目指す。2）に関しては、ミトコンドリアおよびバキュオロ活性を蛍光にて測定する系でそれらの活性と候補遺伝子との関連性を明らかにするまでには至っていない。4)に関しては、スクリーニングに用いる変異株（通常の株が生育できない低鉄濃度の培地でも生育する株）の選定が手間取っており、計画した項目で一番進行が遅れている。
このように、計画した項目について実験を実施しているものの、十分に実施できていない項目があるため、今後、これら完了していない項目について優先的に進めていく予定である。以上をまとめ、本研究課題全般として、やや遅れていると認識している。

Strategy for Future Research Activity

今後は、前年度までに実験が完了していない、鉄代謝制御関わる因子の欠損とミトコンドリアおよびバキュオロ活性との関連を明らかにする。また、抗真菌活性を持つ（鉄代謝を破綻させる）化合物のスクリーニングに用いる変異株の候補のクライテリアを広げ、通常の株が生育できない低鉄濃度の培地でも生育する株だけではなく、高濃度の鉄添加培地でしか生育できない株なども視野にいれて選定を進め、化合物のスクリーニング系を確立する。さらに、鉄欠乏ストレスの応答時に構築される鉄代謝のネットワークの解明を目指す。そのため、下記のような実験を遂行し、鉄欠乏応答システムの全容の解明や感染成立を防ぐための標的分子の提案、抗真菌活性を有する化合物の選出につなげる。
１）CTH2制御下にある遺伝子群の絞り込みとそれら遺伝子の非翻訳領域の共通配列の検索を引き続き行う。共通配列同定後は、それらの配列を含む核酸の添加によるCTH２のヌクレアーゼ活性の阻害状態を測定する。
２）CTH2やその他鉄代謝に関わる転写因子SEF1、鉄取り込みに関わる遺伝子（FET3、FET4、ARN1）の欠損株のミトコンドリアおよびバキュオロ活性の関連を調べる。
３）培養細胞を用いた感染モデルの実験系を完成させる。
４）鉄欠乏応答システムの全容の解明のため、SEF1のtet-OFF株を用い、RNA-seqにより発現がONおよびOFFの時のトランスクリプトーム解析を行う。
５）今まで作成した欠損株から、高濃度の鉄添加培地でしか生育できない株を選抜し、それらを用いての化合物のスクリーニングも試みる。

Causes of Carryover

ミトコンドリアおよびバキュオロ活性の測定や化合物のスクリーニングの実施が十分でなかった。また、トランスクリプトーム解析も実施できなかった。そのため、その際に使用する蛍光試薬や化合物合成に関わる試薬の購入およびRNA sequencingの依託費を本年度に回し、当初の実験計画通り実験を行う。

Research Products

• [Journal Article] Roles of Elm1 in antifungal susceptibility and virulence in Candida glabrata (2020)
  • Author(s): Yuya Ito, Taiga Miyazaki, Yutaka Tanaka, Takashi Suematsu, Hironobu Nakayama, Akihiro Morita, Tatsuro Hirayama, Masato Tashiro, Takahiro Takazono, Tomomi Saijo, Shintaro Shimamura, Kazuko Yamamoto, Yoshifumi Imamura, Koichi Izumikawa, Katsunori Yanagihara, Shigeru Kohno, Hiroshi Mukae
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 10 Pages: 9789
  • DOI: 10.1038/s41598-020-66620-7
  • Peer Reviewed / Open Access