2019 Fiscal Year Research-status Report
Analyses of selenium status and redox control for evaluation of atrophy and insulin resistance with aging
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19K07073
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| Research Institution | Setsunan University |
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Principal Investigator |
上野 仁 摂南大学, 薬学部, 教授 (20176621)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
荻野 泰史 摂南大学, 薬学部, 助教 (80617283)
村野 晃一 地方独立行政法人 大阪健康安全基盤研究所, 衛生化学部, 研究員 (50827277)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | セレン / レドックス / 糖尿病 / サルコペニア / フレイル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
加齢に伴う筋力低下や筋萎縮ならびにインスリン抵抗性を評価するため、生体内セレンおよびインスリン標的組織中のセレンタンパク質発現およびインスリンシグナルのレドックス制御との関係を解析することを目的とする。2019度は、耐糖能異常とセレンタンパク質との関連性について検討するため、2型糖尿病マウスモデルであるNSYマウスを用い、高脂肪飼料を摂取させることにより早期にインスリン抵抗性を発症するマウスモデルを作製した。このモデルマウス作製と同時にL-セレノメチオニン（SeMet）含有飲料水を12週間経口摂取させ、定期的に随時血糖値、耐糖能およびインスリン負荷試験を行った。その結果、NSYマウスに高脂肪飼料を摂取させることで耐糖能が低下するとともにインスリン抵抗性が惹起され、それに加え、SeMetを摂取させることでさらに耐糖能が低下する可能性が示唆された。
一方、耐糖能異常が生じたマウスの血清について、アフィニティカラム精製後、還元化およびアルキル化反応処理し、高速液体クロマトグラフ-飛行時間型質量分析計を用いて検出可能な血清中タンパク質を網羅的に検討した。その結果、血中セレンタンパク質であるセレノプロテインP（SelP）およびグルタチオンペルオキシダーゼ3（GPx3）のペプチドフラグメントについて、各々4個および6個が検出可能であると判明した。
今後、より詳細にinsulin抵抗性とSeMetの影響を明らかにするために、インスリン抵抗性を惹起させたときの肝臓、脂肪組織および下腿腓腹筋およびヒラメ筋中のインスリンシグナル関連タンパク質を調べるとともに、血中のSelPおよびGPx3レベルを解析するについてmRNA発現量を指標とした検討を行う必要があると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
マウスに高脂肪飼料を摂取させることで耐糖能が低下するとともにインスリン抵抗性が惹起され、それに加え、SeMetを摂取させることでさらに耐糖能が低下する可能性が示唆された。これらマウスの膵臓ならびにinsulin標的組織である肝臓、脂肪組織および下腿腓腹筋およびヒラメ筋において、耐糖能異常による発現変化量の多いセレンタンパク質であるGPx1およびSelPのほかに、SelW、SelHなどの発現量についてRT-PCR法およびwestern blotting法により測定する。組織中ROS産生を4HNE抗体を用いた免疫染色法により測定する。
今回確認されたセレンタンパク質のペプチドフラグメントについて、多重反応モニタリング法（Multiple Reaction Monitoring : MRM）を用いて定量的に分析し、相対定量を可能とする手法を構築する。それに加え、血清中タンパク質を網羅的に分析したデータを用いて主成分分析を行い、セレン摂取およびインスリン抵抗性を反映したSelPやGpx3以外のバイオマーカーがあるのか否か探索を試みる。
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| Strategy for Future Research Activity |
2型糖尿病マウスモデルであるNSYマウスに高脂肪飼料を摂取させることにより早期にインスリン抵抗性を発症するマウスモデルの動物実験において、骨格筋を含めたinsulin標的組織におけるセレン負荷およびセレンタンパク質の発現とレドックス状態との関係を解析することにより、GPx1、SelP以外のセレンタンパク質の関与があるのかどうかを見極めたうえで、加齢による筋力低下や筋萎縮およびinsulin抵抗性惹起と、セレンタンパク質発現およびROS産生について解析を行う。
この検討のため老化促進モデルマウスのsenescence-accelerated mouse（SAM）1マウスおよびそのコントロ－ルマウスのSAMR1マウスを用い、NSYマウスの実験と同様の条件で高脂肪試料およびSeMetを摂取させながら30週間飼育する。30週齢のミオシン重鎖筋繊維（type1筋繊維）の比率および面積の測定を行うとともに、NSYマウスの実験と同様に血中SelP、GPx3などの解析、insulin標的組織中のSelW、SelHなどのセレンタンパク質発現量およびROS産生について解析する。さらに，血清中タンパク質を網羅的に分析したデータを用いて主成分分析を行い、セレン摂取およびインスリン抵抗性を反映したSelPやGpx3を含めたバイオマーカーについても同様に検討を行う．
以上の検討により、加齢による耐糖能異常の惹起に伴う骨格筋を含めたinsulin標的組織におけるセレン負荷およびセレンタンパク質の発現とレドックス状態との関係を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
2019年度はNSYマウス，高脂肪飼料および臨床検査キットが主な購入費であり，タンパク質発現などに必要な試薬の購入は2020年度になるため．また，2020年度ではSAMP1マウスを使用予定であるが，このマウスの購入費用が高いため．
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