2019 Fiscal Year Research-status Report
ミクログリアにおけるホスホイノシチドシグナルの病態寄与に関する研究
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19K07080
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
高鳥 翔 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 助教 (80624361)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | アルツハイマー病 / ミクログリア / ホスホイノシチド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アルツハイマー病（AD）の発症機序においては、ミクログリアがアミロイドβ（Aβ）の蓄積に対して神経保護的・障害的な多様な応答を示すことが重要な役割を果たしている。本研究では、ホスホイノシチド（PIPs）がミクログリアによる種々の異常検出に重要であるとの仮説を立て、ADモデルマウスや培養系におけるミクログリアのPIPs動態、機能を解明しその病的意義を明らかにすることを目的とした。
本年度は、ADモデルマウスにおいてPIPs代謝酵素であるInpp5dの欠損の影響を解析し、INPP5DがミクログリアのAβ斑への集簇と、それに付随したアストロサイトの活性化を制御することを明らかにした。さらに、ミクログリアによるAβ線維の貪食を定量化できる実験系を確立し、AD発症リスクに関わる受容体分子TREM2がAβ貪食活性を正に制御すること、また複数のPIPs代謝酵素がその活性制御に関わることを見出した。現在、海外の製薬企業がTREM2を標的としてAD治療薬の開発を進めており、その作用機序としてミクログリアによるAβ貪食が注目されているが、その背景にある分子機序については不明な点が多い。貪食制御におけるPIPsの関与について詳細に解析することにより新たな知見につながる可能性がある。
また、PIPsの動態をさらに詳細に解析するため、PIPsを可視化するツールとして、脂質結合タンパク質に蛍光タグを融合したコンストラクトについて培養細胞株での動作確認を行った。さらにこれをミクログリア特異的に遺伝子導入するため、ミクログリアに最適化されたアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターについての条件検討を行った。今後はこれを神経グリア共培養系などに適用するほか、スケールアップしてin vivoでの脂質可視化にも役立てる計画である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ADリスク因子のひとつであるTREM2の機能低下マウスでは、Aβ斑の近傍で保護的役割をもつとされるミクログリアの集簇が減弱し、神経障害性が亢進する。私たちはこれまでに、このマウスとPI(3,4,5)P3の代謝酵素であるInpp5dの欠損マウスを交配し、ミクログリアの集簇が部分的に回復することを見出していた。昨年度はこの解析を進め、Inpp5dの欠損によりアストロサイトの活性化の程度も回復することや、初代培養ミクログリアを用いてTREM2とINPP5DがPI(3,4,5)P3シグナル経路をそれぞれ正負に制御していることなどを明らかにした。
また、ミクログリアによるAβ貪食を定量化できる実験系を確立し、ADリスク因子の関与について解析を行った。Aβ線維の貪食にはTREM2が重要であり、その下流でPI(3,4,5)P3経路が活性化すること、またPI(3,4,5)P3代謝酵素の発現抑制により貪食活性が亢進することを明らかにした。
一方で、PIPsの役割をさらに詳細に解明するため予定していた、PIPsを可視化する解析に関しては進展がやや遅れている。昨年度中には、組換えAAVベクターを用いてin vitroおよびin vivoのミクログリアにPIPsの可視化プローブを遺伝子導入する実験系の構築を計画しており、その目的のため、ミクログリアへの導入効率が最適化された組換えAAVベクターシステムを開発者であるフロリダ大Golde教授らの協力のもと技術移転した。現在までに初代培養ミクログリアに対してこのベクターを用いることで蛍光タンパク質やshRNAの遺伝子導入が可能であることを確認している。しかし一方で、神経グリア共培養系やin vivoにおいては細胞毒性や感染効率の低さが問題となっており、現在はこれらを改善するための条件検討を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
Inpp5d欠損マウスの解析に関しては、INPP5DがいかにしてミクログリアのAβ斑への集簇を制御しているのかを明らかにするため、脳から単離したミクログリアについて、生化学的な解析を行うほか、遺伝子発現変化についてもRNA-seqなどの手法により明らかにする。また、Aβ線維の貪食過程におけるPIPsの役割解明のため、ミクログリア培養細胞に組換えAAVベクターなどを用いてPIPs可視化プローブを導入し、詳細な解析を行う。
さらに、組換えAAVベクターのデザインや精製法を改良することによって細胞毒性を軽減できるか検討を行い、神経グリア共培養系におけるミクログリアの脂質可視化に応用する。これが奏功した場合にはさらに、組換えAAVベクターの大量調製についても試み、マウスのin vivoのミクログリアに対して同じ手法が適用できるか検討する。これらを通じて、ミクログリアにおけるPIPsを可視化する手法を確立する。
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Research Products
(3 results)
