2019 Fiscal Year Research-status Report
Sulfated polysacharides exert biphasic regulations on inflammation and allergic skin diseases: roles of polysaccharide degradation
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19K07091
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| Research Institution | Hoshi University |
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Principal Investigator |
東 伸昭 星薬科大学, 薬学部, 教授 (40302616)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小宮根 真弓 自治医科大学, 医学部, 教授 (00282632)
東 恭平 東京理科大学, 薬学部薬学科, 講師 (10463829)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | アレルギー性皮膚炎 / ヘパリン / マスト細胞 / ヘパラナーゼ / 基底膜 / サイトカイン / アレルギー性皮膚炎 / 炎症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
皮膚炎症などの炎症において、ステロイド系抗炎症薬とは独立して調節に関わる内在性分子機構として、本研究課題では硫酸化糖鎖（ヘパラン硫酸・ヘパリン・コンドロイチン硫酸）に着目している。具体的には、炎症を惹起・抑制する硫酸化糖鎖の検索をすすめるとともに、これを基質とする酵素で、硫酸化糖鎖の制御因子として重要である基底膜分解酵素ヘパラナーゼの炎症における関与の解析と、活性阻害物質による炎症の調節を試みている。
2019年度は、研究申請書において[課題1]として提案した、ヘパラナーゼの酵素活性を阻害することにより抗炎症効果をもたらす可能性のある糖鎖の検索を行った。内在性糖鎖の一つであるコンドロイチン硫酸のうち、高硫酸型であるE-ユニットを含む糖鎖がヘパラナーゼのヘパラン硫酸切断活性を始め、その生物作用を広く阻害することを見出した。ヘパラナーゼ阻害物質についての検討例は多いが、内在性物質による生理的な活性制御の検討はほとんどなされていない。この視点から新しい研究展開が可能になるものと考えている。E-ユニットによるヘパラナーゼのヘパラン硫酸切断活性の阻害効果は、類似の性質をもつヘパリンに比べると低いものであった。一方、コンドロイチン硫酸の硫酸化度を人為的に上昇させることにより、ヘパリンを超える阻害効果を示す物質の創生に成功しつつある。阻害物質の低分子化は研究申請書提出時点での課題であった。高硫酸化コンドロイチンとして当初調製したサンプルの分子量が15kDaであるのに対し、これを低分子化した5kDa、8kDaの糖鎖断片を作製し、その阻害活性を検討している。一方、異なるアプローチによる阻害物質の創生として、ヘパラナーゼと免疫グロブリンのキメラタンパク質分子の作製を試みている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究申請書時点の具体的な課題として、[課題1] 硫酸化糖鎖断片混合物から起炎症・抗炎症活性をもつ糖鎖を同定する、 [課題2] アレルギー性皮膚炎症疾患の発症におけるヘパラナーゼの関与を検証する、の２つの目標を掲げた。このうち課題1のヘパラナーゼ阻害物質の探索について、また課題2に含めていたヘパラナーゼと免疫グロブリンのキメラタンパク質分子によるヘパラナーゼ阻害効果の発見については、2019年度に一定の成果を挙げたと考えている。ヘパラナーゼと免疫グロブリンのキメラタンパク質分子については、二価の結合部位によるクラスター効果が期待されており、新しい展開が期待される。一方、課題2については、IL-33など炎症性サイトカインのプロセシングにおけるヘパリンとヘパラナーゼの関与について主に細胞レベルで検討する予定であったが、実験系の立ち上げに必要な材料の導入が遅れており、ほとんど進めることができなかった。一方、課題1に含まれる、起炎症活性を有する糖鎖の評価系については、細胞レベルの評価系を立ち上げることができた。マウス個体の解析についてはまだ進められていない。ヒト臨床サンプルの解析については、組織染色に供することができるサンプル数に限りがあったことから、進行が遅れている。ヒト臨床サンプルを用いる研究遂行に必要な申請については手続き済みである。
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| Strategy for Future Research Activity |
課題1・課題2を通じ、活性の強いヘパラナーゼ阻害物質を創生しこれを利用することが、研究遂行の上で一つのポイントになると考えている。今回新規に作製したヘパラナーゼと免疫グロブリンの融合タンパク質は、ヘパラナーゼや免疫グロブリン分子に変異を導入することにより、標的部位や標的細胞に応じたターゲッティング効果を介した最適化が期待される。マスト細胞をはじめとする様々な細胞に対して、今までにない特性のヘパラナーゼ阻害物質として応用する方法論を検討したい。
課題2について、IL-33など炎症性サイトカインのプロセシングにおけるヘパリンとヘパラナーゼの関与について解析する系の構築を目指す。また、ヒト臨床サンプルについては、組織学的解析により疾患部位におけるヘパラナーゼの発現とその役割について検討する。当初の研究計画では、２年目よりアレルギー性皮膚炎症モデルマウスを用いる動物実験を予定していたが、新型コロナウイルス感染症対策の影響としてマスクや消毒液などの恒常的不足が今後も予想される。また、研究の屋台骨を支える担当学生の参加が同様の理由で困難になりつつある。in vitroの検討に軸足を移せるよう、研究計画上の重みづけをシフトさせることを考えている。
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| Causes of Carryover |
2019年度分の配分額に対し、51,179円の次年度使用額が生じた。2019年度は情報収集と年度前半の成果を発表するため、日本糖質学会における発表を行った。また、ヘパラナーゼ依存的なシグナルの解析をする上でのツールと保管場所を確保するための消耗品購入を行った。ヘパラナーゼ依存的なシグナルを検出するために購入が望まれた試薬があったが、残余分の金額では有効なまとめ買い購入ができないことから、見送った経緯がある。2020年度については、これらの試薬購入を進めるとともに、２年目として計画している細胞系、動物疾患モデル、ヒト臨床サンプルの免疫組織学的解析に必要な消耗品類を購入するために予算を充当したい。
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[Journal Article] Chondroitin sulfate E blocks enzymatic action of heparanase and heparanase-induced cellular responses.2019
Author(s)
Higashi N, Maeda R, Sesoko N, Isono M, Ishikawa S, Tani Y, Takahashi K, Oku T, Higashi K, Onishi S, Nakajima M, Irimura T.
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Journal Title
Biochem. Biophys. Res. Commun.
Volume: 520
Pages: 152-158
DOI
Peer Reviewed
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