2020 Fiscal Year Research-status Report
Depolarization-induced contraction of vascular smooth muscle via novel RhoA/Rho-kinase activation.
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19K07108
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| Research Institution | Meiji Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
三田 充男 明治薬科大学, 薬学部, 教授 (50211587)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 血管平滑筋収縮機構 / カルシウム感受性亢進機構 / 低分子量Gタンパク質 / Rhoキナーゼ / Pyk2 / RhoGEF |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ラット尾動脈平滑筋におけるCa2+依存性proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2)を介したRhoA/Rhoキナーゼ(ROK)活性化による新たな血管平滑筋収縮調節機構を解明し、新たな作用機構を持つ循環器系疾患治療薬の創薬につなげることを目的とし、研究実施計画に基づき遂行している。2019年度に続き、2020年度は以下のことを明らかにした。
(1) リアルタイムPCRを用いた解析により、現在まで血管平滑筋で報告があるRhoGEFのArhgef1（p115-RhoGEF)、Arhgef2、Arhgef11 (PDZ-RhoGEF)、Arhgef12 (LARG) 、Arhgef18 (p114-RhoGEF)、Arhgef25（p63-RhoGEF）の6種類の遺伝子が尾動脈平滑筋に発現していることを明らかにした。また、RhoGAPにおいては、GRAF3、p190-RhoGAPの2種類の発現を確認した。現在、それぞれのタンパク質がどの程度尾動脈平滑筋に存在しているのかウェスタンブロット法を用いて確認している。
(2) 60 mM K+刺激による尾動脈平滑筋の収縮における新規Rho阻害物質RhosinおよびY16の効果について検討した。Rhosinは細胞内でRhoAのRhoGEF結合ドメインに結合して、RhoAの活性化を抑制する。Y16はRhoGEFの選択的阻害剤であり、LARGなどのRhoGEFのDH-PHドメインに結合し、RhoA活性化を用量依存的に抑制することが報告されている。60 mM K+収縮はRhosinの前処理により濃度依存的に抑制され、その抑制効果は特に持続相において強く現れた。一方、Y16では抑制効果は見られなかった。Y16はRhoGEFの中でもLARGに対して感受性が高いことより、高K+収縮の持続相においてはLARG以外のRhoGEFが関与すると考える。以上のことよりCa2+流入による収縮の持続相のみがPyk2リン酸化に引き続くRhoA活性化を介したROK活性化機構によるものであることが示唆され、このRhoA活性化にはPyk2を介したY16非感受性のRhoGEFの活性化が関与していると考える。この結果は第63回日本平滑筋学会（2021）で発表予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
2020年3月からのCOVID-19の蔓延および2回にわたる緊急事態宣言発出により、大学内での研究活動が制限されたため、当初の研究実施計画より遅れが出ている。しかし、実施計画に従い、尾動脈血管平滑筋において6種類のRhoGEFおよび2種類のRhoGAPの存在をリアルタイムPCRを用いて遺伝子レベルで明らかにした。現在、タンパク質レベルでの発現量の違いを測定中である。さらには、RhoA阻害薬RhosinおよびRhoGEF阻害薬Y16を用いて、Ca2+流入によるPyk2活性化を介したRhoGEF/RhoA/ROK活性化機構の可能性を明らかにした。
現在も感染者が収束したわけではないが、大学では研究に関しては感染防止に注意を払いながら継続して行う方針であり、ある程度ターゲットとすべきタンパク質も絞られていているので、実施計画の遅れを取り戻すべく今年度は実施計画に基づいて研究を遂行する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）リアルタイムPCRで確認された6種類のRhoGEF及びRhoGAPの尾動脈平滑筋におけるタンパク質発現を、ウェスタンブロット法を用いて確認する。また、免疫沈降法を用いて高K+刺激後のリン酸化されたPyk2と相互作用するRhoGEF及びRhoGAPの同定を行う。
（２）（１）の結果で明らかになった情報伝達系に関与するRhoGEFをsiRNA導入によりノックダウンあるいは各遺伝子導入により過剰発現させたヒト冠状動脈平滑筋細胞（Human Coronary Artery Smooth Muscle Cells）を用いて、高K+刺激によるPyk2リン酸化、RhoA活性化、MYPT1リン酸化及びミオシン軽鎖リン酸化の一連の情報伝達系の変化について検討し、どのようにCa2+依存性Pyk2活性化がRhoA/ROK経路の活性化を導くかを解明する。また、この情報伝達系を阻害する薬物の効果を検討し、最も有効な薬物を探索する。
（３）前年度の研究より、Pyk2と共役しRhoAの活性調節（RhoGEFの活性化）にPI3Kが関与することが示唆された。そこで、関与するPI3Kアイソフォームについて リアルタイムPCR法、ウェスタンブロット法及び免疫沈降法を用いて検討し、PI3K、Pyk2、RhoA活性化までの情報伝達機構に関わるタンパク質について明らかにする。
以上の研究により、血管平滑筋におけるCa2+依存性RhoA/ROK活性化に関係するPyk2を介した新しい情報伝達機構が解明でき、さらには、血管平滑筋の緊張を調節する従来から用いられている受容体遮断薬やチャネル阻害薬のような膜タンパク質に作用する既知の薬物とは異なる新たな作用点をもつ薬物を探索することができる。そして本研究により得られた結果を取りまとめ、学会及び論文等でこの成果を公表する。
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| Causes of Carryover |
昨年度は感染症蔓延及び緊急事態宣言の発出もあり、研究も中断せざるを得ない状況で、研究も計画通りには進行しなかった。そのため、特に学会発表をすることができず、またすべての学会がオンライン開催だったため、学会参加のための旅費等の経費をほとんど使用しなかった。そこで、特に学会参加の経費のために、残額は次年度に繰越し、当該年度分と合わせて使用する。
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| Remarks |
1. Sugi T, Nishigami Y, et al. Leuk Lymphoma. 2021 Jan 28: 1-12. doi: 10.1080/10428194.2021.1876867.
2. Sugi T, Mita M, et al. J Clin Pharm Ther. 2021 May 7: 1-4. doi: 10.1111/jcpt.13433.
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