2019 Fiscal Year Research-status Report
細胞内局在性ムスカリン受容体の生体における機能解析
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19K07117
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| Research Institution | Asahikawa Medical College |
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Principal Investigator |
宇和田 淳介 旭川医科大学, 医学部, 助教 (70580314)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
矢澤 隆志 旭川医科大学, 医学部, 講師 (00334813)
加藤 剛志 旭川医科大学, 医学部, 准教授 (60194833)
谷口 隆信 旭川医科大学, 医学部, 教授 (60217130)
益岡 尚由 金沢医科大学, 医学部, 准教授 (80509307)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ムスカリン受容体 / GPCR / acetylcholine |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、これまで細胞の表面でのみ機能すると考えられてきたムスカリンM1受容体の細胞の内部における機能性を明らかにすることを目的としている。計画では遺伝子編集による細胞内M1受容体を欠失したマウスの作出を初年度の目標としていたが、一部計画を変更してin vitroの実験系での研究を中心に遂行した。これまで、細胞内部に局在するM1受容体の活性化は、膜透過性の異なるリガンドを利用して間接的に調べる方法がとられてきた。これをより直接的かつリアルタイムに検出する方法を開発するため、受容体活性化に伴う構造の変化を受けて蛍光特性の変化する循環置換cpGFPをムスカリンM1受容体に導入した。実際に刺激による活性の検出に成功しており、現在は細胞内M1受容体の活性検出に向けてcpGFP導入位置の調整などを行っている。また、ムスカリン受容体ファミリーのうち、M1サブタイプの細胞表面への発現が低い原因を明らかにした。これはM1受容体の一次構造に由来しており、生体内におけるM1サブタイプとM3サブタイプの使い分けに関して示唆を与える結果であるとともに、先のcpGFPによるムスカリン受容体活性検出系の感度向上にも寄与する知見である。細胞内M1受容体の活性化にはアセチルコリンの細胞内への取り込み活性が必要である。この取り込み系について明らかにするため、放射性同位元素でラベルしたアセチルコリンを使用したアセチルコリン取り込みの実験系を確立し、トランスポーターのスクリーニングを開始した。現在いくつかの候補トランスポーターを同定済みである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の目的は、細胞内に局在するムスカリンM1受容体の機能性を遺伝子編集による細胞内M1受容体を欠失したマウスの作出により解析することであるが、研究施設における動物実験施設の改装など、いくつかの理由によりこれを延期し、一部計画を変更してin vitroの実験系での研究を中心に遂行した。cpGFPを利用した細胞内M1受容体活性系の開発は、細胞内でM1受容体が活性化されることを直接的に証明する手段となりうるものであり、アセチルコリンの取り込みも間接的に示すことができる。この方向性を見出したことは重要な進展である。また、アセチルコリン取り込みの放射性同位元素を用いた実験系を確立し、順次トランスポーターのスクリーニングを進める事により、実際にいくつかの候補トランスポーターを見つけることができた。従来アセチルコリンはエステラーゼによりコリンへと分解されて細胞内へ取り込まれるとされており、アセチルコリン自体の取り込みは想定されてこなかった。今回得られた知見はそれを覆す取り込み系が存在することを示唆しており、本研究の目的に沿う細胞内M1受容体機能解析に重要は進展を与えるものであり、概ね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞内M1受容体を欠失したマウスの作出については、遺伝子編集のための設計などの準備を済ませており、実際の実施については動物実験施設の改装状況、新型コロナウイルスによる研究環境への影響を含め、状況を見極め判断することとし、より多くの成果を得るため多角的に本研究を遂行する。cpGFPによる細胞内M1受容体活性の検出を重要課題として取り組み、更にその他のin vitroを中心とした研究を重ね、得られた知見を目的である生体における細胞内M1受容体の解析へフィードバックできるよう準備を進める。
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| Causes of Carryover |
動物実験を使用する一部の計画について、研究施設の環境の変化などを考慮して延期したため、次年度使用額が生じた。次年度の使用に関しては、引き続き状況を見つつ、新型コロナウイルスによる影響も考慮しながら検討を進め、初年度に成果を得られたin vitroの研究に援用しつつ効率よく、多くの成果を得られるよう柔軟に計画を進める。
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