バクテリオファージの産業利用を目指したファージバンクの構築

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07146
• Research Institution: Gifu University
• Principal Investigator: 稲葉 桂子 (長谷川桂子) 岐阜大学, 大学院医学系研究科, 研究員 (40448709)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: バクテリオファージ / ファージバンク / 薬剤耐性菌 / ファージセラピー

Outline of Annual Research Achievements

前年度に引き続き、主に緑膿菌に感染できるファージの探索を行なった。新たに、NBRCとその他の機関から系統的に多様で薬剤耐性株が多数含まれる緑膿菌株を入手した。PAO1株、PA14株とこれまで使用してきた緑膿菌臨床分離株も使いながら、特に薬剤耐性株を殺菌できるファージの探索を進めた。
これまでのファージ探索を通じて、臨床分離株に感染できる緑膿菌ファージは土壌や川といった自然環境よりも、下水や畜産動物の生育環境から採取しやすいことが判明している。今年度は岐阜市内の下水処理プラント施設より流入下水、活性汚泥などを採取させていただいた。上記の株を宿主としてファージ探索を行なった結果、新たに20種類以上のファージを得ることができた。

今年度はファージ探索に加えて、ファージの殺菌活性測定法の改良を試みた。具体的には96穴マイクロタイタープレート中でファージを標的細菌に感染させた後、宿主菌の濁度をプレートリーダーで測定することでファージ感染の有無や感染の程度を解析する方法である。マイクロタイタープレート内で反応させる宿主とファージの濃度及び反応時間等を検討し、従来の寒天プレートを用いた結果を反映できる感染条件を決定した。この方法により、多数の菌株または多数のファージを用いた感染実験解析を簡便に迅速に行うことができる。実際にこの方法によってファージの宿主域の検定や殺菌活性の測定を行い良好な結果を得た。また、ファージ間の宿主域を精査し、収集したファージのグループ分けを実施した。
今年度のファージ探索では、薬剤耐性緑膿菌に感染できるファージは期待したほど得られなかったが、今後も同様の手法によってファージ探索とファージの特徴づけ、保存を続ける予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

2021年度は多剤耐性緑膿菌を含む緑膿菌臨床分離株を多数入手し、より多様性に富む緑膿菌ファージの探索を試みた。また、ファージの宿主域を調べる際にプレートリーダーの利用を考案し、条件検討及びハイスループット化を進めた。菌株の入手及びファージの特徴づけについては順調に進んだ。
一方で、新型コロナウイルス感染症の蔓延等により計画に遅れが生じた。具体的には、当初計画していた口腔サンプルの採取は今年度も実施できず、また、下水の採取に関しては時期や頻度等に制限を設けざるを得ず、採取対象も岐阜市に限定することになった。これにより、標的細菌を主に緑膿菌とし、得られるファージの数や種類も限定的になってしまったと考えている。
緑膿菌以外の細菌を宿主としたファージ探索とファージのデータベース構築は計画通り進めることができなかったため、2022年度の課題として進めていく予定である。

Strategy for Future Research Activity

多剤耐性化して問題となっている黄色ブドウ球菌、クレブシエラ属菌、アシネトバクター属菌を標的としたファージ探索を実施していく予定である。
これまでに入手した緑膿菌標準株と臨床分離株を用いてプロファージの誘発も実施する予定である。既にいくつかの株からプロファージの誘発に成功しており、単離作業を進めている。順次、宿主域の確認、特徴づけ等を進めていく。

収集したファージの中で有用性が高いと考えられるものについては全ゲノム配列を決定し、アノテーション付け等、精査を進める。
本研究成果について、データベース化していきたいと考えている。

Causes of Carryover

実験計画の進捗にやや遅れが生じており、遅れた分を次年度に繰り越した。使用計画に変更はなく、「物品費」として研究用消耗品、「旅費」として国内学会参加に関わる費用、「その他」として論文投稿にかかる費用を計上する予定である。