2021 Fiscal Year Research-status Report
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19K07153
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| Research Institution | Yokohama College of Pharmacy |
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Principal Investigator |
高橋 哲史 横浜薬科大学, 薬学部, 准教授 (40449004)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 膵臓がん / エクソソーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度に引き続き、肝転移性臓がん細胞株KMP2に対し、エクソソーム関連因子の3’末端への発光タンパク質部分配列HiBiTのノックインを試みた。前年度までにCas9による切断部の両端の相同領域を15bp程度のドナーベクターを用いるノックイン法であるPITCh法により検討を行ってきたが、これまでのところノックイン細胞は得られていなかった。本年度はノックイン時のドナーベクターの改変を行い、LoADシステムを併用したノックインの条件検討を行った。EF1プロモーター制御によるEGFP発現ベクターをポジティブコントロールとして、トランスフェクションの条件から検討し直した結果、一過性にトランスフェクション効率が高い試薬よりも、トランスフェクション効率は低いものの細胞毒性も低いトランスフェクション試薬の方でノックイン効率が高いことが明らかとなった。そこで最適なトランスフェクション条件下、Cas9による切断部の両端の相同領域を800bpまで伸ばしたドナーベクターと、LoADシステムの各種ベクターを用いてCD63下流へのHiBiT-2A-puroRのノックインを試みた。その結果、ピューロマイシン耐性細胞株が得られ、得られた染色体DNAを解析した結果、設計通りにCD63の3’末端にHiBiT-2A-puroRがノックインされていた。そのため、エクショソーム濃縮試薬と併用することにより、KMP2細胞が分泌するエクソソームをCD63を指標としてハイスループットに定量することが可能となった。
また、複数の膵臓がん細胞を3D培養し、RNAseq解析を行い、がん幹細胞化に関わる遺伝子の比較をおこなった。その結果、多くの膵臓がん細胞において、3D培養することによりCD24の発現上昇が認められた。さらに、これらの細胞においてゲムシタビンへの感受性の低下が認められた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
使用した細胞の組換え効率が悪く、ノックイン細胞を得るのに想定した既存の方法では得られなかった為、既存の方法を改良するため時間を有した。
プラスティック製品の供給遅延により、実験が一部予定通りに行えなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、構築したHiBiTノックイン細胞を用い、エクソソーム分泌に対する漢方薬の影響について検討する。また、構築した細胞が分泌するエクソソームをHiBiT由来の発光強度でモニタリングすることが可能であることから、エクソソーム標的細胞（Kupffer細胞を想定）へのエクソソームの取り込み実験を行い、定量的な評価法の構築を目指す。
膵臓がん細胞へのHiBiTノックイン法が確立したことから、CD63以外のエクソソームマーカー遺伝子（CD9）やエクソソーム中に含まれる転移制御因子（EPS8）について、同様に3'末端にHiBiTをノックインする。
今後、CD24と抗がん剤抵抗性との関連についても検討する。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍により消耗品の物流の遅延により実験計画に遅れが生じた。次年度において、前年度までに構築した発光エクソソームを分泌する細胞を使用し、漢方薬の活性について評価するため、発光基質試薬及び細胞培養プレート（3D用）の消耗品試薬が必要である。また、成果報告のための費用も必要である。
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Research Products
(2 results)
