2019 Fiscal Year Research-status Report
マクロファージを標的とした輸血後鉄過剰症治療薬の探索
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19K07181
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| Research Institution | Kobe Tokiwa University |
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Principal Investigator |
井本 しおん 神戸常盤大学, 保健科学部, 教授 (50263380)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
澤村 暢 神戸常盤大学, 保健科学部, 講師 (20709042)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 輸血後鉄過剰症 / 鉄キレート剤 / フェロトーシス / フェリチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、① マクロファージのヘム鉄による細胞死を鉄キレート剤と協働的に抑制する薬剤を見つける ② フェリチン発現量の変動がマクロファージのヘム鉄による細胞死に及ぼす影響を調べる の2点である。
本年度実施した主な研究内容は、以下の3項目である。1）3種類の鉄キレート剤（deferasirox (DSX)、deferoxiamine (DFO)、deferiprone(DFP)）のヘミン誘導性細胞死抑制効果を比較した。 2）フェロトーシス阻害剤ferrostatin-1 (FS1) と鉄キレート剤DSXとの併用効果を検証した。 3）細胞内フェリチン量をウェスタンブロッティング（WB）で測定し、負荷する鉄量と誘導される細胞内フェリチン量を比較検討した。得られた研究成果は以下の通りである。
1）について：ヘミンによる細胞死誘導を抑制する効果は、DSX>DFO>DFP であった。
2）について：DSX（20μM）にFS1を同時添加したが、ヘミン誘導性細胞死の抑制効果はDSX単独とほぼ同レベルであり、FS1併用による相乗効果は検出できなかった。
3）について：複数の抗体を比較し、抗フェリチン重鎖抗体によるWBで最も良好な結果が得られることが判った。鉄負荷によるフェリチン誘導作用は、鉄化合物の種類によって異なり、クエン酸アンモニウム鉄（FAC）ではヘミンよりも高いフェリチン誘導作用を示すことが判った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
目的①についての進捗状況；１）鉄キレート剤の細胞死抑制効果の比較： ヘミン誘導性細胞死の抑制効果を、3種類の鉄キレート剤（DSX、DFO、DFP）で比較した結果、抑制効果はDSX>DFO>DFP であることが判った。また、DSXは100μMでは軽度の細胞毒性を示すが、20μMでは細胞毒性を示すことなく細胞死を抑制できることが判った。DFOはDSXに次ぐ抑制効果を示し、高濃度でも細胞毒性を示さなかった。2）DSXとFS1の併用効果： DSXとFS1 の併用によるヘミン誘導性細胞死の抑制効果は、DSX単独とほぼ同レベルであり、DSXとFS1の併用が相乗効果を示さない、という結論が得られた。
目的②についての進捗状況；細胞内フェリチンのWBを、抗フェリチン軽鎖抗体、抗フェリチン重鎖抗体、抗フェリチンポリクローナル抗体、を用いて比較した結果、抗フェリチン重鎖抗体で最も良好な結果が得られた。鉄負荷後のフェリチン量をヘミンとFACで比較した結果、細胞内フェリチン量はヘミン負荷では増加せず、FAC処理では負荷前の約4倍に増加することが判った。また、ヘミンとFACでは負荷後の細胞内非ヘム鉄は同程度に増加するにもかかわらず、FACでは細胞死や活性酸素種（ROS）が誘導されなかった。FACではフェリチン増加が細胞内不安定鉄（LIP）の増加を抑制できるためではないか、と推測している。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究の主目的である「輸血後鉄過剰症の治療に鉄キレート剤と協働作用を示す薬剤の探索」を、2019年度内に実施できなかった薬剤を用いて順次進めていく。オートファジー阻害剤などフェリチン量を変動させる薬剤についても検証していく予定である。
これまでの研究結果から、細胞内LIPとフェリチン量の重要性が示された。2020年度は細胞内LIPの定量測定、細胞内フェリチン量のより定量的な測定を実現していく。それらにより、薬剤の作用をより適確に解析し、より有望な薬剤を見つけていくことを目指す。
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| Causes of Carryover |
併用により鉄キレート剤との協同作用を示す薬剤の探索を、未実施の薬剤を用いて順次進めていく必要がある。併用薬剤としては、抗酸化剤（α-tochopherolなど）およびビスホスフォネート（マクロファージの貪食抑制作用を示す）について検証していく予定である。また、これまでの結果からDSXとDFOの併用により細胞毒性を高めることなく抑制効果を示す可能性が示されたため、両者の併用効果も検証していく。オートファジー阻害剤など細胞内フェリチン変動が期待できる薬剤についても検証を進める必要がある。さらに、細胞内LIPのcalcein とFCMによる定量測定、細胞内フェリチンのELISAまたはFCMによる定量測定を実現し、薬剤作用をより的確に解析することも重要である。
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