2020 Fiscal Year Research-status Report
Construction of early diagnosis and prognosis prediction system by monitoring of cancer-related antigen CSPG4 specific autoantibodies.
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19K07197
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| Research Institution | University of Shizuoka |
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Principal Investigator |
伊藤 邦彦 静岡県立大学, 薬学部, 教授 (90221770)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井上 和幸 静岡県立大学, 薬学部, 准教授 (90514589)
辻 大樹 静岡県立大学, 薬学部, 講師 (90565615)
平井 啓太 静岡県立大学, 薬学部, 講師 (30740203)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4 / がん関連抗原 / 自己抗体 / がん診断・予後モニタリング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2020年度は、抗CSPG4自己抗体測定系の構築について検討した。ヒトCSPG4強制発現293T細胞より細胞膜画分を抽出し、これを抗原ソースとする予定であったが、細胞膜画分中に含まれるCSPG4をサンドイッチELISAで定量した結果、予想を下回る収量しか得ることができなかった。293T細胞における発現が十分ではなかったことが理由として考えられた。そこで、CSPG4高発現のヒトメラノーマ由来MDA-MB-435S細胞からCSPG4の抽出について検討した。その結果、測定系の構築のために必要十分量のCSPG4を得ることができた。
測定系の構築については、CSPG4の細胞外ドメイン3を認識する抗CSPG4ポリクローナル抗体をキャプチャー抗体とし、モデル自己抗体として我々が単離したヒト型リコンビナントFab AHSA(Antibody against HeLa Surface Antigen)を用いたサンドイッチELISAについて検討した。本測定系では、キャプチャー抗体濃度10 ug/ml、抗原濃度30 ug/mlの至適条件下でAHSAは1000 ng/mlから10 ng/mlの範囲で検出可能であった。自己抗体の検出限界は５ng/mlであった。測定系の日内および日差変動の変動係数は10％未満と良好であった。
サンドイッチELISAによる測定系で得られた結果を評価する上で、偽陽性を排除する必要があると考えらえる。そこで、サンドイッチELISAでCSPG4と反応することが確認できた検体について、間接蛍光抗体法(IIF)により確認するための系を構築した。ヒト血清とは交差反応性が極めて低いマウス由来細胞株としてBALB/3T3 cloneA31を選択し、CSPG4強制発現系を構築した。AHSAをモデル自己抗体として用いた時、強制発現細胞とのみ強く反応することを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
2020度実施予定の研究計画のうち、抗CSPG4自己抗体測定系の構築については、サンドイッチELISAおよび間接蛍光抗体による測定系の構築について完了することができた。しかしながら、同時に行う予定であったCSPG4陽性細胞を使った担がんモデルマウスを作製し、経時的に血中CSPG4自己抗体を検出するという実験は着手まで至らなかった。新型コロナウイルス感染拡大防止のために4月から5月の2ヶ月間は大学への入構ができずに在宅ワークとなり、実験を進めることができなかったことが理由のひとつとしてあげられる。また、担がんモデルマウスを作製する上で、BALB/c由来RenCa細胞を使う予定であったが、RenCa細胞へのCSPG4発現プラスミドの遺伝子導入が全くうまくいかず、検討に長時間を要してしまったことがふたつ目の理由としてあげられる。RenCa細胞のかわりに同じBALB/c由来BALB/3T3 CloneA31を用いたところCSPG4発現プラスミドが効率よく導入されたので、2021年度実施予定の実験に加えて担がんモデルマウスの実験を行う予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
2021年度は、本研究の最終年度であり、本研究の最終目標であるがん患者血清中の抗CSPG４自己抗体のバイオマーカーとしての有用性について検討を行う。バイオバンクジャパンより各種がん末期の患者の血清を分与して頂き、血清中IgG画分の精製と自己抗体のサンドイッチELISAおよびIIFによる検出を行い、抗CSPG4自己抗体が高値となるがん種の絞り込みを行う。次に、絞り込んだがん種について、抗CSPG4自己抗体が、がんの早期から検出できるのか、また、化学療法や外科手術によってがんを治療した時に正常レベルまで低下するのかについて、患者のモニタリングを行うことによって明らかにしていく予定である。本臨床研究は、本学研究倫理審査委員会およびバイオバンクジャパン研究倫理審査委員会の承認のもと実施する予定である。
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