2019 Fiscal Year Research-status Report
核内受容体による薬物応答をモデルとしたエピゲノムセンサーの評価系確立と探索
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19K07200
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| Research Institution | Iwate Medical University |
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Principal Investigator |
幅野 渉 岩手医科大学, 薬学部, 准教授 (50332979)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 核内受容体 / エピゲノム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒトは生体外のストレス（環境物質や薬物の曝露、低酸素・栄養）に応答し、様々な反応をする。このとき生体外の異物（リガンド）と細胞内の遺伝子発現の橋渡しをするのが核内受容体である。我々は、核内受容体AhR（aryl hydrocarbon receptor）を介した発現誘導がDNA脱メチル化剤の処理で増強することを見出した。AhRが特異的に結合するXRE（xenobiotic responsive element）には、DNAメチル化の標的となるCpG配列が含まれる。そこで本研究課題では、AhRが標的遺伝子のDNAメチル化状態により応答性を制御する「エピゲノムセンサー」として役割を果たす可能性を推測し、その分子機構の証明とAhRの結合応答性を評価する新しい手法の開発を試みた。2019年度は、4種のヒト肝臓がん細胞（HepG2、HuH7、JHH4、JHH5）を対象に、AhR抗体を用いたクロマチン免疫沈降（ChIP）を実施した。AhRリガンドであるβ-ナフトフラボンの曝露によりCYP1B1遺伝子発現量が増加するとともに、AhRと結合するCYP1B1遺伝子内のXRE配列の量も増加する傾向が認められた。さらに、沈降物に含まれるAhRと結合した標的配列（XRE）におけるDNAメチル化状態を解析した結果、沈降前と比べメチル化レベルが低いことが確認された。これより、AhRは非メチル化状態の標的配列と選択的に結合することが明らかになり、AhRを介した応答性が標的配列のメチル化状態により制御される可能性が示唆された。メチル化状態の異なるXRE配列とAhRとの結合応答性を評価する新しい手法の確立に向け、その基盤となる研究成果が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
クロマチン免疫沈降の条件検討に予想以上の労力と出費を要したが、使用するキットを変更するなどして対処したい。その他については予定通りに進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
我々は、標的配列のDNAメチル化状態とAhRの結合応答性を評価する新しい手法の開発を目指し、前年度においてはクロマチン免疫沈降とメチル化解析を組み合わせた方法について研究成果を得た。そこで、次年度以後は別の手法であるデコイを用いた結合阻害実験系の確立を目指す。まず、標的XRE配列を含むデコイ（二本鎖DNA）を標識し、共焦点顕微鏡を用いて細胞内への取り込みを確認する。このデコイの細胞内導入により、β-ナフトフラボンによるAhRを介したCYP1B1遺伝子の発現誘導が抑制された場合には、AhRのデコイへの結合が推測される。そこで、XRE配列をメチル化した同じ塩基配列のデコイを作成し、同様に細胞内へ導入したときのCYP1B1遺伝子発現誘導への影響を評価する。非メチル化デコイの導入で観察された発現誘導の抑制が検出されない場合には、AhRの非メチル化XREへの選択的結合の可能性が示唆される。AhR抗体を用いたクロマチン免疫沈降で非メチル化XRE配列が選択的に回収されたことと合わせると、AhRを介した応答性が、標的配列のメチル化状態により制御されることが推測できる。このモデルを使って細胞内で起こる核内受容体と標的配列の結合応答性を評価する手法を確立するとともに、同様のメカニズムにより制御される他のエピゲノムセンサーの探索を試みる。
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| Causes of Carryover |
残額が少ないため（265円）、使用できなかった。そのため翌年度分と合わせて使用する予定である。
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Research Products
(1 results)
