薬物代謝酵素シトクロムP450の性特異的制御におけるmicroRNAの役割

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07228
• Research Institution: Ohu University
• Principal Investigator: 佐久間 勉 奥羽大学, 薬学部, 教授 (30250468)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 性差

Outline of Annual Research Achievements

薬物代謝酵素は体内における薬物の分解を担い、薬効や有害作用の発現を調節する酵素群である。その活性には男女差・雌雄差が存在する。本研究は薬物代謝酵素の活性に性差が生じる原因を明らかにし、性差およびその変動に起因する薬物の有害作用、薬物間相互作用の予測に役立つ情報を明らかにすることを目的としている。本年度はマウスを用いた解析を行い、肝臓においてメス特異的に発現するマウスCyp3a41の調節に関わる核内受容体の活性調節機構の一端を明らかにした。
CYP3A遺伝子はHNF4αやVDRにより調節される。両核内受容体はリン酸化による活性調節を受け、それにより標的遺伝子であるCYP3A遺伝子の発現に影響を与える。核内受容体には核内受容体間で高度に保存されたリン酸化部位が存在し、共通の調節機構となっていると予想される。HNF4αのDBDにおける保存されたリン酸化部位であるSer68、Ser75、Ser76は、リン酸化によって転写活性化能が低下することが、模擬リン酸化変異体を用いたレポーター遺伝子解析によって示唆された。同様にVDRではDBD内のThr32、Thr40、LBD内のSer335のリン酸化によってビタミンD依存的転写活性化能が低下すること示唆された。臨床において男女別の投与量が推奨されているピオグリタゾンをリガンドとするPPARγにおいても、DBD内のSer392のリン酸化によるリガンド依存的転写活性化能の低下が示唆された。
本研究では性差が生じる一因としてmicroRNAの関与に注目している。性特異的発現を示すCyp3a41a, 3a41b, 3a44, 2a4, 2d9 mRNA及び上記のリン酸化に関わる可能性のあるキナーゼmRNAについて、ウェブ上のmicroRNA結合部位予測サイトを用いmicroRNAによる調節の可能性を探索したところ、VDRについて１つ候補が挙がった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究では、マウス遺伝子発現の解析に肝細胞初代培養系を用いる。しかし、代表者が使用しているプロトコルは未だ完成度が低く、遊離肝細胞の回収率が不安定である。可能な限り最適な条件で調製しても季節や実験場所による回収率の低下が起こり、予定している実験に必要な数の細胞を準備出来ないことがしばしば起こり、研究の進捗に悪影響が現れた。また、遊離肝細胞を回収できた場合であっても、細胞の状態が良くなく薬物代謝酵素および調節関連因子の発現が低い場合もあり、これら使用している肝細胞初代培養系の不安定さが研究進行を妨げる要因となった。

Strategy for Future Research Activity

現在までの進捗状況に記した様に、状態の良いマウス初代培養肝細胞の安定的な回収が研究進捗の律速になっている。理由は不明であるが、冬季より夏季の方が細胞回収率が高い。マウス肝細胞初代培養系を使う実験を夏季に集中させ、実験が安定して進行できるように工夫したい。マウス初代培養肝細胞の代替として、安定して細胞を用意できる株化培養細胞の利用も検討したい。これらの改善により、研究の進行速度を上げられるようにしたい。

Causes of Carryover

現在までの進捗状況に記した様に、研究の進行が遅れた為に次年度使用が生じた。令和２年度には、マウス初代肝細胞系の培養条件を改良すること並びにマウス肝細胞初代培養系を利用した実験の実施時期を調整することで、進捗の遅れを取り戻す予定である。遅れを令和２年度に取り戻す予定であり、使用計画内訳に大きな変更はない。