2020 Fiscal Year Research-status Report
遺伝子改変両生類を用いた新たな骨リモデリング機序の解析方法の確立
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19K07245
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| Research Institution | Shizuoka University |
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Principal Investigator |
雪田 聡 静岡大学, 教育学部, 准教授 (80401214)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中村 浩彰 松本歯科大学, 歯学部, 教授 (50227930)
林 利憲 広島大学, 両生類研究センター, 教授 (60580925)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 両生類 / 軟骨内骨化 / 骨代謝 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題は哺乳類において骨代謝に関わることが知られいている遺伝子OPG, RANK, RANKLを標的とし、CRISPR/Cas9システムによりこれらの遺伝子を欠損したネッタイツメガエルおよびイベリアトゲイモリを作出して骨への影響を検討することで、両生類と哺乳類の骨代謝の分子機構がどの程度保存されているかを明らかにすることを主な目的としている。
初年度は、イベリアトゲイモリ、ネッタイツメガエルともに遺伝子欠損個体の作出までは至らなかった。しかし、条件検討を重ねることにより2年目ではイベリアトゲイモリ、ネッタイツメガルともにPCR法による簡易的なgenotypingの結果、Opg遺伝子を欠損していることが強く期待される個体を複数作出した。現在、これらの個体について次世代シークエンサーを用いたアンプリコンシークエンスによってゲノム編集効率を確認中である。
さらに、これらの個体から四肢の長管骨を採取し、組織学的に検討を行った。OPG遺伝子は哺乳類において破骨細胞分化を抑制的に調節するため、両生類においてもOPG欠損個体は破骨細胞数の増加が予想された。しかし予想に反してOPG欠損イモリ、カエルともに破骨細胞の数および局在は野生型と同様であった。このことは、OPG遺伝子が両生類においては破骨細胞分化制御に大きく関与しない可能性を示唆している。
3年目はOPG遺伝子の他、RANK、RANKL遺伝子欠損にも着手して、OPG遺伝子と同様に両生類の軟骨内骨化を介した長管骨形成における破骨細胞分化にRANK/RANKL/OPGシグナルがどのように関与しているのかを明らかにするため研究を進展させる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初予定では、OPG, RANK, RANKL遺伝子の欠損個体作出を2020年度中に成功させる予定だったが、新型コロナウイルス感染症対策のために実験時間の確保が難しかった時期が生じたためにOPG遺伝子欠損個体の作出に遅れが生じたこと、OPG遺伝子欠損が想定外の表現型であったために確認の例数を増やしたこと、ネッタイツメガルにおいてRANK遺伝子を標的としたgRNAの顕微注入が高い致死性を示したことなどにより、RANK,RANKL遺伝子欠損個体は現在まだ得られていない。
一方でOPG遺伝子欠損両生類においては複数個体を得ることができており、組織学的な解析の結果から、両生類と哺乳類とでRANK/RANKL/OPGシグナルが異なる役割を担う可能性を示唆する結果も得られ始めている。
以上のことから、全体として大幅な計画の遅延ではなく軽微な計画の遅れと判断しており、2021年度はRANK, RANKLの遺伝子欠損個体の作出を急ぎつつ、OPG欠損個体の遺伝子発現検討などを行い、両生類の骨形成におけるOPG遺伝子の役割を明らかにしていきたいと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
OPG遺伝子欠損個体については、次世代シークエンサーによる詳細なゲノム編集効率を明らかにし、高効率に遺伝子欠損を受けている個体を選出して骨組織検討を行う。その際、破骨細胞の数や局在はもとより、骨芽細胞や軟骨細胞、骨細胞に対する影響も検討するとともに、電子顕微鏡を用いた細胞形態に着目する。また、イベリアトゲイモリにおいては四肢再生過程における骨組織再生が野生型とOPG欠損個体とで異なるかも確認する。加えて、イベリアトゲイモリおよびネッタイツメガルの骨組織においてOPG, RANK, RANKL遺伝子の局在をin situ hybridization法により明らかにする。
RANK,RANKL欠損についてもgRNAおよびCas9タンパク質の濃度などの条件検討を行い欠損個体を作出する。両遺伝子欠損個体についてもOPG欠損個体の場合と同様の評価を行い、両生類の骨形成における両遺伝子の役割を明らかにする。
これら3つの遺伝子の骨形成に対する役割を検討することで、総合的にRANK/RANKL/OPGシグナルが両生類においても破骨細胞分化を制御するのかについて明らかにする。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス感染症対策のため、学会出張費が抑えられたため。
また、使用する消耗品の種類や量、購入する時期を工夫することにより最大限物品費を抑えるよう努力した結果、当初予定よりも消耗品費を削減できたため。これはゲノム編集を含む分子生物学的実験に使用する消耗品として次年度使用する予定である。
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