2020 Fiscal Year Research-status Report
新規非分解系エンドサイトーシス経路の生理的機能と病態との関連
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19K07248
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| Research Institution | Kagawa University |
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Principal Investigator |
川合 克久 香川大学, 医学部, 助教 (80534510)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
荒木 伸一 香川大学, 医学部, 教授 (10202748)
江上 洋平 香川大学, 医学部, 講師 (80432780)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | macropinocytosis / macrophage / Rab GTPase / optogenetics |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の解析対象であるマクロパイノサイトーシス様の新規輸送経路は次の特徴を示す。（１）取り込みの初期の段階でマクロパイノソーム様の構造から長い管状構造を形成する。（２）マクロパイノソーム様の構造のカップが閉じずに消滅する。これまでに我々は、マクロパイノソーム様構造および出芽した管状構造にはRab10が強く局在することを見出している。初年度に作製した受容体可視化プローブを用いRAW264細胞においてRab10陽性新規輸送経路に各種受容体（TLR, CD16など）および各種細胞膜可視化プローブ（FM4-64, ConAなど）が局在するのかを検討した。その結果、いずれの受容体もRab10陽性新規輸送経路に局在が見られたが積極的に受容体および膜プローブが濃縮することは無かった。
次にRab10陽性新規輸送経路におけるRab10の局在化機構について調べた。Rabタンパク質の局在は一般的にC末端側の約20アミノ酸残基が担っていることが知られている。そこでRab10のC末端領域を別のRabタンパク質（Rab1a, Rab13）と入れ替えたキメラタンパク質を作製し、RAW264細胞において観察した。その結果、Rab10のN末端側の領域（約180 aa）を含むキメラタンパク質はRab10陽性新規輸送経路に強く局在した。一方、Rab10のC末端側の領域（約20 aa）を含むキメラタンパク質はRab10陽性新規輸送経路に局在が見られなかった。よって、Rab10の新規輸送経路への局在はN末端側が担っており、一般的なRabの局在とは異なる非常に興味深いものである。おそらくRab10のN末端側領域に強く結合する因子がRab10陽性新規輸送経路に局在しており、それをターゲットにしてRab10はRab10陽性新規輸送経路に局在してくると考えられる。今後、Rab10の局在化機構について解析を進める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度作製した各種プローブを用いRab10陽性新規輸送経路への解析を行った。様々な分子が局在するものの、期待していた特定の分子が特に多く存在することは見られなかった。さらに様々なRab10のキメラ変異体を作製しRab10の局在化機構について解析を行った。Rab10の局在化について従来とは異なる非常に興味深い結果が得られた。現在までに、Rab10の局在化決定因子を探索するためのRab10の結合タンパク質の可視化プローブは作成済みである。PI(3,4,5)P3のRab10陽性新規輸送経路への抑制的な関与については、Rab10の局在化あるいはRab10の活性化が関係していることが予想される。現在、Rab10 (RabGEFあるいはRabGAP)の可視化プローブを作製済みである。またPI(3,4,5)P3の直接の関与を調べるために複数のPI3K阻害剤あるいはPI3Kのオプトジェネティクスツール（PA-PI3K）を用意している。PI3Kのオプトジェネティクスツールについては現在までにRAW264細胞における顕微鏡下での局所的な活性化を行う実験系を確立している。
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| Strategy for Future Research Activity |
Rab10陽性新規輸送経路によって運ばれるものを同定する。現在、様々な受容体についてRab10陽性新規輸送経路に局在はするものの積極的に運ばれているものは見いだせていない。本年度は、さらに複数の受容体および膜プローブについて検討を行う。非常に興味深いことにRab10は一般的なRabタンパク質とは異なりN末端側の領域が局在に関わる。昨年度作製した多数のRab10結合タンパク質の可視化プローブを用いRab10の局在化機構を明らかにする。イノシトールリン脂質代謝酵素のオプトジェネティクスツール（PA-PI3KあるいはPA-5-Pase）を用いRab10陽性新規輸送経路におけるイノシトールリン脂質代謝の関与を明らかにする。この実験ではRab10の活性調節因子（RabGEFあるいはRabGAP）の寄与も解析していく予定である。
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| Causes of Carryover |
過年度において購入済みの消耗品などを使用したため、当該年度に購入する物品を抑えることが出来た。次年度では、確立した実験系での膜成分の挙動を検出するため、様々な受容体の抗体、あるいはFM4-64などの膜成分の検出試薬およびRab10キメラ変異体やRab10結合タンパク質を作製するための合成遺伝子の購入を予定している。また、当該年度の年度末に予定していた学会参加において旅費として計上していたものが、新型コロナウイルス感染症の影響により学会がオンライン発表となったために旅費の使用がなくなった。
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