The functional analysis of semaphorin in the neural network formation and higher brain function.

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07249
• Research Institution: Sapporo Medical University
• Principal Investigator: 谷口 雅彦 札幌医科大学, 医学部, 准教授 (70260346)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 軸索ガイダンス / 脳神経系 / ノックアウトマウス / 神経発生 / 高次脳機能 / 神経回路形成

Outline of Annual Research Achievements

複雑な脳神経系において機能的な神経回路が形成されるためには、標的細胞への神経軸索の正確な投射が必要である。この過程を制御する分子として軸索ガイダンス分子が存在し、セマフォリン、スリット、エフリン、ネトリンが同定されている。これらの分子がどのように神経回路形成に関与しているかという分子機構はまだあまり研究が進んでいない。主として反発性軸索ガイダンス分子として機能するセマフォリンに注目して研究を進めている。本研究の目的は、神経回路形成及び高次脳機能におけるセマフォリンの機能を解明することである。セマフォリンは当初軸索ガイダンス分子として同定され、神経系での研究が進んできた。その後の研究によりセマフォリンは約30種類同定されており、セマフォリンはウイルスからヒトに至るまでの生物に存在する。セマフォリンは神経系以外でも免疫系、癌発生、血管形成、骨形成等に関与しており、創薬のターゲット分子となり得る分子である。
以前マウスにおいて新規セマフォリンであるSema3Gのクローニングに成功した。現在は、特にSema3Gに注目して研究を進めている。Sema3Gは神経系の研究がほとんど進んでいない。Sema3Gは成体脳において主に小脳の顆粒細胞層と海馬に発現している。Sema3Gの機能解析が本研究課題の最大の目的である。Sema3Gの機能解析を行うためにノックアウトマウスを作成した。現在はノックアウトマウスを使用して形態学的解析と行動学的解析を主に行っている。形態学的解析では様々な抗体を使用した解析を海馬と小脳に対して行ったが、現在の所明らかな異常はまだ見付けられていないので、抗体の種類と染色法を増やして解析を続けているところである。行動解析に関しては計画していた実験はほとんど終わったところである。成果は得られたが、現在はその確認をしているところである。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

神経回路形成及び高次脳機能におけるセマフォリン（特にSema3G）の機能を解明することを目的としている。Sema3Gのノックアウトマウスはすでに作成に成功している。このマウスにはLacZ遺伝子が挿入してあるので、X-Gal染色によりSema3Gの発現を簡単に解析できる。このマウスを使用してSema3Gの発現を詳細に解析した。その後、形態学的解析と行動学的解析を当初の計画通りノックアウトマウスを使用して解析を進めている。行動解析にはオスマウスが大量に必要なのだ
が（ほぼ同じ週齢のノックアウトマウスとコントロールマウスをそれぞれ約20匹）、マウスを増やすのに予想より時間が掛かったが、ほとんど問題なく行動解析を進めることができ、計画していた行動解析はほとんど終了した。今はその成果を確認中である。また、形態学的解析も様々な抗体を使用して解析を行ったが、予想していたような成果はまだ得られていない。今後は別の抗体及び染色法等を使用した解析と視点を変えた形態学的解析を行っている。このようにほぼ順調に研究は進展している。

Strategy for Future Research Activity

今後も今までと同様に脳神経系におけるセマフォリンの機能解析を進めていく計画である。最大の目的はノックアウトマウスを使用した形態学的解析と行動学的解析だが、今後は培養系を使用したシグナル伝達の解析も進めていきたい。この解析に使用する予定の発現ベクターを現在作成中である。形態学的解析には解析方法が多種類存在するので、様々な方法を試してみることを計画している。また、可能なら電気生理学的解析も行いたい。これらの解析により、神経系におけるセマフォリンの機能を明らかにして、高次脳機能や神経疾患治療に有益な成果も得たい。現在まで研究はほぼ順調に進んでいるので、今後も計画通りに研究を進めていきたい。

Causes of Carryover

形態学的解析に使用した抗体等がメーカーのキャンペーン価格の利用等により計画より安くなった。行動解析に必要な費用とマウス飼育の費用も計画より安くなった。また、これが一番大きな理由であるが、コロナウイルス感染拡大による移動自粛により出張がなくなったために研究費の次年度使用が生じた。
使用計画だが、申請書に記載した計画通りに研究を進める予定である。具体的には、セマフォリンノックアウトマウスの形態学的解析、行動学的解析、シグナル伝達解析である。これらの解析において生化学実験試薬、免疫染色用抗体、プラスチック器具、マウス等を使用するので、これらに研究費を使用する。次年度使用になった研究費の分が増えたので、より多くの抗体や試薬が購入できるので、さらに解析が進むと考えられる。また、現在の日本や世界の状況が落ち着くのが条件であるが、次年度は出張が計画通りに可能になることを希望する。