2019 Fiscal Year Research-status Report
Identification and dynamic analysis of true stem cells in testicular stem cells using the latest single cell analysis method
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19K07250
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
大保 和之 横浜市立大学, 医学研究科, 教授 (70250751)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
富澤 信一 横浜市立大学, 医学部, 講師 (00704628)
尾野 道男 横浜市立大学, 医学部, 助教 (50264601)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 生殖細胞 / 幹細胞 / エピジェネティクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生体の組織の生理機能を、個体の一生涯正常に保つために、いくつもの臓器で、幹細胞システムが機能している。精巣の幹細胞は、次の世代へ、すべての遺伝子情報を伝える精子の元となる細胞であり、他の組織幹細胞と異なり、何らかの伝達情報に異常が生じると、次の世代の異常や生存に関わる問題が引き起こされる。従って、精巣の幹細胞の持つ維持、分化機構の研究を行うことにより、その特殊な生殖戦略を知ることができる。しかし、現在、どの細胞が本当の幹細胞であるのか、幾つかの説があり結論を得ていない。一つの仮説は、シスト状に分裂しても繋がり増殖する精原細胞において、最初の１個の細胞のみが幹細胞であるという説である。それに反する仮説として、３、４回分裂後の、膜型チロシンキナーゼKitを発現する段階以前の精原細胞は、均一な幹細胞集団として機能しているという説がある。シングルセル解析は、このような、細胞集団の均一性の有無を評価するには、最適な手段である。そこで、私共は、DNAメチル化、RNA発現など、複数の評価項目を、同一の細胞から解析する手法を用いて、精巣の幹細胞の存在様式を解析することを計画した。解析は、次世代シークエンサーを用い、全ゲノムレベルでの解析を行う。これにより、未分化な精原細胞を、より細かく、幾つかの異なるエピジェネティックな指標により分類し、ほぼ均一な細胞なのか、幾つかの亜分画に別れるのか検証する。2019年度は、まず成体のGFRa1陽性の細胞を、Kit陰性、陽性の２つの分画に分け、シングルセルにしてFACSにより純化を行った。これより、scNMT法によるライブラリー作成を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
すでに準備していた精原細胞のみにGFPを発現する、GFRa1-GFPマウスを用い、膜型チロシンキナーゼであるKitの発現の有無で、まず、大まかに２つの分画に分け、それぞれの分画について、FACSを用いて、シングルセル・ソートを行った。収集した余りの細胞をプールして、Kit陰性の精原細胞に高く発現している分子、Kit陽性の精原細胞に高く発現している分子、精巣にあるライディッヒ細胞やセルトリ細胞に発現している分子について検討したところ、矛盾なく、高度な純度で、細胞分離がうまくいっていることを確認した。これらの実験を1セットとして、計2セット分のサンプルを取得した。1セット目のサンプルについて、それぞれ、RNA、DNAを抽出し、ライブラリーを作成した。さらに、一部は次世代シークエンサーを用いて、遺伝子情報の解析を行った。これらに関しては、得られたデータの解析を行っているところである。RNAの解析が、一番進んでおり、ほとんどが転写因子であるが、Kit陰性精原細胞の中でも、存在様式が異なる分子が複数同定されている。Kit陽性精原細胞には、それほど、シングルセルレベルで、分布の違いを顕著に示す分子は、これまでのところ同定されていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
継続して、次世代シークエンサーを用いた遺伝子情報の解析、および、そこから得られるデータの解析を実施する予定である。遺伝子発現、DNAメチル化、クロマチンアクセシビリティーの解析結果に加え、私共が、これまで蓄積してきた、Kit陰性、陽性の精原細胞を集団として採取して解析した、様々なヒストン修飾の結果などとも合わせて検討し、特にKit陰性細胞集団の中から、亜集団に分けられる分子を絞り込む。このステップで、今後得られるDNAメチル化、クロマチンアクセシビリティーのデータ解析の結果を重ね合わせ、最終的に、亜集団の分類を完成させる予定である。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が少額であるため、今年度中に支払いに最適の物品がなかったため。
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