2019 Fiscal Year Research-status Report

上陸時の器官進化の保守と革新を可視化するGCM２複合体標的遺伝子座の網羅比較解析

Research Project

Project/Area Number	19K07258
Research Institution	Jikei University School of Medicine
Principal Investigator	岡部正隆東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (10300716)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	CRISPR/Cas9 / Gcm2 / APEX / マウス / ゼブラフィッシュ
Outline of Annual Research Achievements	本年度は「GCM2と協働するコファクターを同定するための遺伝子組換えゼブラフィッシュと遺伝子組換えマウスの作製」を行うことを計画した。ゼブラフィッシュに関しては、Gcm2遺伝子座にノックインするAPEXタグ配列の両端にGcm2タンパク質C末端のコーディング領域のホモロジーアームを持つDNAコンストラクトをPCRで作製し、必要なgRNAとともにゼブラフィッシュ受精卵にマイクロインジェクションし、ノックインゼブラフィッシュ(Gcm2-APEX)の作製を試みた。マイクロインジェクションした胚からゲノムDNAを抽出し、標的配列周辺の塩基配列を確認したところ、Gcm2遺伝子座の当該塩基配列の切断は確認できたものの、APEX配列遺伝子の挿入は確認できなかった。さらに、Gcm2タンパク質N末端のコーディング領域を標的としたAPEX配列挿入用DNAコンストラクトをPCRで作製し、同様にノックインゼブラフィッシュ(APEX-Gcm2)の作成も試みたが、こちらも同様にノックイン個体の作製には至らなかった。マウスに関しては、報告されている様々なノックインコンストラクトの中から3’末端のホモロジーアームを長くする方法を採用し、1本鎖DNAを作製し、必要な4種類のgRNAを用いてTAKE法によりノックインマウス作製を試みた。近年標準的に使用されるC57BL/6N系統を用いてノックインマウス作製を試みたが、エレクトロポレーション法による遺伝子導入後の胚発生率が著しく低く、子宮内への胚移植を行うも妊娠を維持することが困難であった。そこで、使用するマウス系統をC57BL/6Jに変更したところ、2個体の産仔が得られたが個体を維持することができなかった。死亡した仔マウスのゲノムDNAを解析したところ目的部位にノックインされていたことは確認した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason ノックインゼブラフィッシュの作製に関しては、ここ数年で複数のグループにより研究開発が進んでおり、いくつかの方法が報告されている。PCRにより作製した二本鎖DNAを用いてノックイン動物の作製を繰り返し試みているが、ノックイン個体を得るに至っておらず、進捗がやや遅れる結果となった。ノックインマウスに関しては、胚発生率低下の原因究明に時間がかかり、結果として用いるマウス系統を変更することで克服できることがわかったが、原因究明に時間がかかり研究計画の進捗が遅れた原因となっている。また、所属学部の教育業務との兼ね合いの中で、1月～3月にかけて重点的に実験計画を進める予定であったが、都内のコロナウイルスの感染拡大のために研究実施が予定通り進まなかったことも、進捗が遅れる原因の一つとなった。
Strategy for Future Research Activity	ゼブラフィッシュに関しては、2020年度中にノックイン動物を系統化することを目標にして研究を実施する。これまでノックインが成功に至らなかった原因として、ノックインDNAコンストラクトにPCRで作製した２本鎖DNAを用いていることではないかと考えている。そこでノックインDNAコンストラクトには環状プラズミドDNAを用いることとし、マイクロインジェクション後に受精卵内で切断される方法(Hisano et al, Sci Rep 2016）を用いて行う。ゼブラフィッシュは性成熟が３ヵ月と短く、ノックインした個体が一度得られれば、短期間で系統化のためのF1個体を得ることが可能であり、その後の個体数を増やすのも容易である。マウスに関しては、系統を変更しノックインマウスの作製には成功しているので、同じ方法でノックインマウスの系統樹立を再度試み、コアファクター同定にかかる実験に必要な個体数を確保する。ノックインマウス作製時には、前年度の反省も踏まえ育児経験豊富な仮親を用いる。それぞれのノックイン動物を作製している間には、Gcm2-APEXを導入した培養細胞を用いて、ビオチン化された蛋白の精製方法を確立し、遺伝子組換え動物の準備ができ次第、速やかにGCM2コファクター同定のための質量分析を進めることとする。