2022 Fiscal Year Research-status Report
上陸時の器官進化の保守と革新を可視化するGCM２複合体標的遺伝子座の網羅比較解析
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19K07258
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| Research Institution | Jikei University School of Medicine |
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Principal Investigator |
岡部 正隆 東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (10300716)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | マウス / ゼブラフィッシュ / Gcm2 / HEK293 / 転写 / TAD / APEX |
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| Outline of Annual Research Achievements |
APEX2を結合したマウス及びゼブラフィッシュのGCM2（GCM2-APEX2）をマウスHEK293細胞株に導入し、APEX2によってビオチン化される分子の細胞内局在を比較した。マウスGCM2-APEX2では、ビオチン化された分子は核で少なく、細胞質に多く検出された。一方、ゼブラフィッシュGCM2-APEX2では、ビオチン化された分子のほとんどが核に検出された。マウスGCM2タンパク質自体は培養細胞内に検出されにくく、ゼブラフィッシュGCM2タンパク質は核に強く検出されることから、ゼブラフィッシュGCM2タンパク質は安定して核内にとどまるのに対し、マウスGCM2タンパク質は核から細胞質に移動して分解されている可能性が示唆された。
２種のGCM2間の転写活性化能をルシフェラーゼアッセイにより定量化した。48時間の結果では2種で大きな違いは認められなかったが、両者の転写活性化ドメイン(TAD)を入れ替えた様々なキメラGCM2を作成し転写活性化能を比較したところ、マウスのTAD2はゼブラフィッシュのTAD2よりも高い転写活性化能を示した。さらにこれらに比較して、ゼブラフィッシュTAD1-マウスTAD2のキメラGCM2は、非常に高い転写活性化能を示すことも明らかとなり。TAD1とTAD2の組み合わせによって転写活性化能が大きく変化することが明らかとなった。2016年Guan等がヒトGCM2のTAD1内の1アミノ酸置換がhyperparathyroidismを引き起こすことをすでに示しているが、今回の実験でも、TAD1とTAD2の両者が転写活性化能の制御に重要な役割を果たすことが示唆された（第45回日本分子生物学会年会、第128回日本解剖学会総会・全国学術集会にて発表）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
当初予定していたAPEX導入動物作成は成功せず、マウスの甲状腺組織のATAC-seqで当初予定していたオープンクロマチン領域を特定する方法を検証し、外部委託（アクティブ・モティフ）にて検証を試みたが、採取できる細胞の数が少ないことから非常に困難であった。
そこで、Gcm2－APEX2を導入した培養細胞でビオチン化した分子の可視化に成功したため、培養細胞を使用して詳細な解析を行うことにした。現在はこのビオチン化されたタンパク質の同定に向けた解析を行っている。また、培養細胞の実験結果から、種間におけるGCM2の機能差が、GCM2そのもののアミノ酸配列の違いによって引き起こされる可能性を見出しており、進化の過程で起こったGCM2のTADを含む構造変化が協働するタンパク質を変化させ、下流の評定遺伝子を変化させた可能性に注目している。
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| Strategy for Future Research Activity |
理研BRCより提供されるラット由来の副甲状腺培養細胞（PT-r）と、Santa CruzのCRISPR KO ベクターを用いてGcm2KO細胞を樹立する。さらに、PT-r細胞とGcm2KO細胞でATAC-seqを実施し、オープンクロマチン領域を比較することで、GCM2がパイオニアファクターとしての機能を持つか否かを検証するエピゲノム解析を行う。また、GCM2のコファクターを同定のために、PT-r細胞にGCM2-APEX2を導入して、副甲状腺細胞内でGCM2と協同するコファクターの同定をする。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルスの流行により教育業務の負担増など、研究遂行に問題が生じたこと、さらに動物作成や副甲状腺組織を用いた解析が困難であることが明らかとなるまでに時間を要したことから、当初の予定通りの予算執行ができなかった。
実施可能な別の方法を検討する必要があったため、次年度に別の方法で実施する計画に変更した。変更した実施計画では、ラットの副甲状腺細胞を用いて正常細胞とGcm2のKO細胞を作成し、ATAC-seq、RNA-Seq、cut&runの解析を行う。
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Research Products
(2 results)
