マスト細胞の脱顆粒応答は分泌刺激の種類で変化するか？―イメージングによる解析―

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07272
• Research Institution: Iwate Medical University
• Principal Investigator: 東尾 浩典 岩手医科大学, 教養教育センター, 講師 (50342837)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 齋野 朝幸 岩手医科大学, 医学部, 教授 (40305991) ; 横山 拓矢 岩手医科大学, 医学部, 講師 (70772094)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 細胞生物学 / マスト細胞 / エキソサイトーシス

Outline of Annual Research Achievements

マスト細胞はI型アレルギーや炎症反応に関与する免疫担当細胞であり、様々な生理活性物質を分泌顆粒に貯留し、分泌刺激を受けて内容物を開口放出（脱顆粒）する。脱顆粒の様式は神経伝達のような教科書的な分泌様式とは大きく異なり、その実態も分子メカニズムもほとんど明らかになっていない。本研究では脱顆粒過程の可視化によりそれらの解明を目指している。
分泌顆粒はリソソーム関連オルガネラであり内腔のpHは5程度であるが、脱顆粒によって細胞外液が流入すると中性となる。このレンジのpH変動はpH感受性緑色蛍光タンパク質pHluorinによって可視化できる。そこで、分泌顆粒局在の膜貫通タンパク質の内腔側にpHluorinを、細胞質側に赤色蛍光タンパク質mCherryをつないだ融合タンパク質を考案し、脱顆粒インジケーターとして機能するかを様々な条件で検証した。そして、目論見どおり、この融合タンパク質が「脱顆粒の有無」と「分泌顆粒の局在・挙動」の両方を可視化することを確認した。
抗原刺激、compound48/80刺激およびTPA+A23187刺激は、脱顆粒研究における代表的な分泌刺激であるが、刺激によって脱顆粒応答が異なる。この背景を探るべく、本研究では上記脱顆粒インジケーターを用いて、分泌刺激ごとの脱顆粒様式を1細胞まるごと超解像レベルで4Dライブイメージングした（理研との共同研究）。その結果、分泌顆粒は多数の大きなクラスターを形成して細胞深部に存在すること、クラスター間に一過的なtubule様構造を介した連絡が生じること、抗原刺激時にはクラスターを離れた分泌顆粒が細胞辺縁へ移動して脱顆粒すること、TPA+A23187刺激時にはクラスター内／間で脱顆粒が逐次的に生じること、A23187単独刺激時にはクラスター内の逐次的脱顆粒が優勢になること、等が見出された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

分泌顆粒の挙動と脱顆粒を同時モニターする新規インジケーターの開発が想定よりも早期に完了した。そのため、予備実験としての、一般の共焦点レーザー顕微鏡を用いた3Dライブイメージング（XY軸＋時間軸）に十分な時間を割くことができた。その中で、分泌刺激の濃度条件・脱顆粒タイムコース・蛍光強度変化の特性・脱顆粒様式の差異等に関する様々な情報を収集し、不都合にも十分対処してきたことが、共同研究先に長期滞在しての順調な4Dライブイメージングにつながった。そして多くの新知見を得ることができた。

Strategy for Future Research Activity

分泌顆粒の挙動や脱顆粒の場を正確に把握するためには、細胞膜を可視化する必要がある。また、より高精細な4Dライブイメージングを行うためには、脱顆粒インジケーターの退色を軽減させる必要がある。これらの技術的課題をクリアして、まずは今回見出した現象をよりインパクトある形で報告したい。その後、この系をプラットフォームとして、分泌刺激特異的な脱顆粒様式をもたらす細胞内要因、およびそれを制御している分子基盤を研究計画に基づき解明したい。

Causes of Carryover

次年度以降の脱顆粒分子メカニズム解析に先立って今年度、脱顆粒を制御する遺伝子の発現を抑制するためのプラスミド（siRNA発現プラスミド）の作成を行ってきたが、作成できた個数が当初予定より少なかったため計上予算を下回った。生じた次年度使用額は引き続き、今年度分と合わせてsiRNA発現プラスミドの作成に用いる。