2019 Fiscal Year Research-status Report
シュワン細胞の発生・成熟における硫酸化糖脂質の生理的意義の解明
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19K07277
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| Research Institution | Kansai Medical University |
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Principal Investigator |
和田 幸恵 (平原幸恵) 関西医科大学, 医学部, 講師 (70457969)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | シュワン細胞 / ミエリン形成 / スルファチド欠損マウス / 質量顕微鏡 / EMARS法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
末梢神経髄鞘形成細胞であるシュワン細胞において、硫酸化糖脂質（スルファチド）は分化マーカーとして使われているにもかかわらず、その機能は不明である。一方、中枢神経髄鞘形成細胞オリゴデンドロサイトにおいてもスルファチドは分化マーカーであり、われわれは、スルファチドの多様な構造バリアントがオリゴデンドロサイトの発生過程において時間的空間的に特徴のある発現を示すことを最近報告した。また、われわれはかつて、モデル動物を作製し、スルファチドの欠損がオリゴデンドロサイトの成熟異常・ミエリン形成異常を起こして重篤な神経障害を導くなど、スルファチドが髄鞘形成に重要な役割を果たすことも明らかにしている。本研究は、これまでオリゴデンドロサイトに関して得た知見と、これまでに培った機能解析技術を駆使して、末梢神経すなわちシュワン細胞におけるスルファチドの機能を解明することを目的とする。本年度は、シュワン細胞発生・成熟過程にフォーカスし、 （１）スルファチドバリアントをマーカーとした細胞系譜の探索 （２）スルファチドと共局在する分子の同定をおこなうためのEMARS法の確立をおこなった。シュワン細胞におけるスルファチドバリアントの分子種は、未成熟シュワン細胞から発現しており発生過程により変化することが明らかとなった。EMARS法に関しては、スルファチドに対する抗体DI8を用いた手法でスルファチドを高発現している腎臓がん細胞を用いて確立した。これによってシュワン細胞においてスルファチド分子種の近傍の分子を同定する方法が確定し、時期特異的なスルファチド分子種と供局在する分子を検出する術が整ったことになる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
質量顕微鏡によるシュワン細胞発生過程のスルファチドバリアントの同定には、今までの研究で発生過程の後根神経節（DRG）のスルファチドの発現を確認しているニワトリ胚を使用した。ニワトリ胚５日目でイオンm/z 778.50 ( C16脂肪酸をもつ スルファチド)、 m/z 806.50 (C18脂肪酸をもつスルファチド) 、m/z 888.6 (C24脂肪酸に二重結合をもつC24:1 スルファチド) を同定した。さらに発達が進むに連れてm/z 890.7 （C24 スルファチド）やm/z 862.6 (C22スルファチド)が加わることがわかった。さらに免疫染色法にて、 DRG と背根神経において未熟シュワン細胞のマーカーであるSox2、Sox10がスルファチド特異的抗体DI8陽性細胞と共局在をしていた。これらの結果は、スルファチドバリアントは未成熟シュワン細胞から発現しており、DRG発達に何らかの機能を果たしている可能性を示唆していた。さらに、スルファチドと共局在する分子の同定を進めるため、EMARS法の確立をおこなった。手法の確立のため、スルファチドが高発現している腎がん細胞KMRCとスルファチドに対する抗体DI8を用いEMARS反応を行った。スルファチド近傍に集積するタンパクをTyramide-FITC で効率よくラベルでき質量分析に十分量の膜画分を回収することができた。質量分析をおこなったところ、腎がん細胞でのスルファチド近傍の候補分子のリストをあげることができた。この手法により、シュワン細胞ステージ特異的スルファチド近傍分子群の同定を目指す。
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| Strategy for Future Research Activity |
今まではスルファチド分子種の同定が比較的容易にできるニワトリ胚、腎がん細胞等を使い、スルファチド分子種が発現する細胞同定、スルファチド分子種近傍分子を同定する方法の確立をおこなってきた。今後は、ツールをマウスにシフトし、DRGにおけるスルファチド分子種の欠損による影響を解析する。マウス胚に対する質量顕微鏡解析においては、ニワトリ胚で解析するよりもターゲット分子の量的な問題でイメージングが難しい。感度をあげる測定条件の検討をおこないながらマウス胚DRGにおけるスルファチド分子種の発現を調べる。同時にスルファチド分子種が発現する細胞の同定、時期の確定を行う。EMARS法をシュワン細胞に施すため、シュワン細胞の大量培養を始め、上記で確立した抗体DI8-EMARS反応をシュワン細胞に施し、スルファチド共存分子候補のリストを挙げる。また、未熟シュワンから発現している可能性を示す結果は出したが、それらが、無髄シュワン細胞、有髄シュワン細胞両方に発現し続けるのか、あるいは分子種によって発現のパターンが異なるのかといった詳細な結果はまだ出ていない。それらの情報を免疫染色法と質量顕微鏡イメージング法を使い、各マーカーと照合して確定していく。
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| Causes of Carryover |
前年度に予定したEMARS法の確立に時間がかかり、ルーティン解析をすることができず、昨年度の予算があまり、今年度に当初予定した解析を回すことになった。当初の使用予定からの変更をおこなっている。
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