2019 Fiscal Year Research-status Report

希少糖を用いたナトリウム・グルコース共輸送体の糖透過性の分子構造基盤解析

Research Project

Project/Area Number	19K07301
Research Institution	Kagawa University
Principal Investigator	神鳥和代香川大学, 医学部, 助教 (40457338)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	藤原祐一郎香川大学, 医学部, 教授 (20532980)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	SGLT / トランスポーター / 電気生理学 / 希少糖
Outline of Annual Research Achievements	ナトリウム・グルコース共輸送体(SGLT)は、体内で単糖をナトリウムとともに細胞内に取り込む膜タンパク質である。このうちhuman SGLT (hSGLT )1は主に小腸における糖の吸収を、hSGLT2は腎臓における糖の再吸収を担っている。一方SGLTは種々の癌細胞で高発現し、過度のグルコース取り込みおよび細胞増殖に寄与している。以上のことからSGLTは糖尿病や癌の診断・治療法のターゲットとして注目されており、SGLTの分子レベルでの糖輸送メカニズムの解析は臨床応用につながる重要な知見となる。本研究ではSGLTの糖輸送の選択性について、二本刺し膜電位固定法による電気生理学的手法を用いて解析している。また香川大学で世界に先駆けて研究が進んでいる自然界にわずかしかない単糖、希少糖も含めて検討を行っている。本年度の解析の結果、hSGLT1はグルコース、ガラクトースのみを輸送し、アロースなどの希少糖を含むその他6種類のアルドヘキソースは輸送しないことが明らかになった。次に構造学的解析を用いてhSGLT1の糖輸送、糖選択性に関与するアミノ酸を予測した。単糖輸送体のうち唯一結晶構造が報告されている、腸炎ビブリオ由来ナトリウム・ガラクトース共輸送体とガラクトースとの複合体の構造を基に、hSGLT1の糖結合部位の構造を予測した。この解析から糖の結合・輸送に関与する可能性が高いアミノ酸の部位特異的変異体を作成し、種々の単糖の輸送能を検討した。その結果hSGLT1の複数のアミノ酸が糖輸送、および糖選択性において重要な役割を担っていることが明らかになった。さらに他の変異体および他のSGLTについて同様の解析を進め、SGLTの糖輸送・選択性の全容を解明することが期待される。これらの解析はSGLTをターゲットとした糖尿病や癌の診断・治療法の開発へとつながり、その中で希少糖を利用できる可能性もある。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当初の予定通り、まずhSGLT1の糖輸送の選択性について二本刺し膜電位固定法による電気生理学的手法を用いて検討を行った。その結果hSGLT1はこれまでの報告の通りグルコース、ガラクトースを輸送した。SGLTについて8種類すべてのアルドヘキソースの輸送能を検討した報告はこれまでにないが、今回hSGLT1はグルコース、ガラクトース以外の6種類のアルドヘキソースを輸送しないことを明らかにした。またhSGLT1の糖結合部位付近の構造を予測し、糖の結合・輸送に関与する可能性があるアミノ酸の部位特異的変異体を作成し、希少糖を含む種々の単糖の輸送能を検討した。その結果hSGLT1 T287およびY290はアミノ酸置換によって糖選択性が変化することが明らかになった。これらのアミノ酸は糖結合部位付近に存在するにもかかわらずSGLTのサブタイプによっていくつかのパターンを示すことから、糖選択性を決定するカギになっていると考えられる。またW291の変異体は糖輸送能が消失することが明らかになった。このアミノ酸はすべてのSGLTで保存されており、糖輸送に必須のものと考えられる。以上の結果はSGLTの分子レベルでの糖輸送機構を理解するための重要な知見である。またhSGLT2-5および他の種由来SGLTのクローニング、電気生理学的解析を順次進めている。予定通り、順調な進捗である。
Strategy for Future Research Activity	本年度に引き続き、二本刺し膜電位固定法によりhSGLT1変異体、hSGLT2～5および他の種由来SGLT（野生型および変異体）の糖輸送能・選択性の解析を行う。さらにこの方法では糖輸送の検出が難しいサブタイプについては、voltage clamp fluorometry法、ITCカロリメトリー、接触液胞2重膜法などにより、糖輸送能を検討する。これらの解析結果から、SGLTの糖輸送および糖選択性の分子メカニズムの全容が詳細に明らかになると期待される。また種々の変異体について、希少糖を含めた輸送能の解析を行うことにより、オリジナリティのある研究になる。さらにここまでの電気生理学的解析から得られた結果を基に、株化培養細胞で野生型および変異体SGLTを強制発現させ、糖選択性の解析結果と細胞増殖、酸化ストレスなどとの関係を検討し、本研究の結果を臨床応用へとつなげていく。
Causes of Carryover	国内外の状況から、予定していた学会出張へ行くこと、および購入を予定していた試薬の年度内納入が困難になったため。