2020 Fiscal Year Research-status Report
活動依存的な細胞標識技術を用いたフェロモン記憶形成におけるシナプス伝達変化の解析
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19K07302
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| Research Institution | Kochi University |
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Principal Investigator |
谷口 睦男 高知大学, 教育研究部医療学系基礎医学部門, 准教授 (10304677)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
村田 芳博 高知大学, 教育研究部医療学系基礎医学部門, 助教 (40377031)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 電気生理学 / 鋤鼻系 / シグナル伝達 / 相反性シナプス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は、前年度の研究で明らかにしたバゾプレシンのV1a受容体を介するIPSC抑制作用の作用点の同定をさらに進めるため、CNQX およびAP5 を用いて僧帽細胞から顆粒細胞へのグルタミン酸作動性シナプス伝達を遮断しておき、顆粒細胞から僧帽細胞へのGABA作動性シナプス伝達に対するバゾプレシンの作用点が、シナプス前機構か後機構によるのかの特定を試みた。
まず前年度に引き続き、僧帽細胞にパッチ電極を適用し、TTX存在下において顆粒細胞膜の自発性興奮により生じるGABA作動性IPSCを膜電位固定下で記録した。バゾプレシンの細胞外投与によりmIPSCの発生頻度・大きさについて、累積度数分布解析を行って例数を増やしたが、やはり僧帽細胞ごとのばらつきが大きく、有意差は検出できなかったが、少なくとも顆粒細胞から僧帽細胞へのGABA作動性シナプス伝達に作用点があることを示唆する結果は得られた。
そこで次に、バソプレシンの作用点がシナプス前膜側（つまり顆粒細胞側）にあるかどうかに重点を置いて調べた。シナプス前機構を介する仕組みの中で広く受け入れられている機構は、シナプス前細胞のCa2+電流の修飾である。そこで、顆粒細胞にパッチクランプ法を適用して顆粒細胞のCa2+電流を測定したところ、バゾプレシンの細胞外投与によりCa2+電流が抑制されることを見出した。
以上の結果は、バゾプレシンのIPSC抑制作用が顆粒細胞‐僧帽細胞間GABA作動性シナプス伝達のシナプス前機構を介して生じるとする前年度の結果をさらに確かなものにした。
また、上記相反性シナプス電流に対するバソプレシンの抑制作用を多角的に捉えるため、プレリーハタネズミ（一夫一婦型齧歯類）を用いて、研究対象細胞の僧帽細胞からの基本的な電気応答の記録に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該年度は、バゾプレシンの、細胞レベルでの作用（具体的には相反性シナプス電流に対する作用点）をさらに明らかにすることを目標とした。上記相反性シナプス電流に対する抑制作用に関わっているバゾプレシンの作用点について、顆粒細胞から僧帽細胞へのGABA作動性シナプス伝達に関する新たな知見が得られた。この知見は、シナプス前側とシナプス後側の記録からそれぞれ得られた成果である。フェロモン記憶に必須である上記相反性シナプス伝達の特性に関する従来の知見を着実に発展させるものである。
また、上記相反性シナプス電流に対するバソプレシンの抑制作用を多角的に捉えるため、プレリーハタネズミ（一夫一婦型齧歯類）を用いて、研究対象細胞の僧帽細胞からの基本的な電気応答の記録に成功した。以上から、当該研究は順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1) 相反性シナプス電流に対するバゾプレッシン受容体の作用
当該年度は、相反性シナプス電流に対する抑制作用を有するバゾプレシンの作用のうち、顆粒細胞から僧帽細胞へのGABA作動性シナプス伝達について、特にシナプス前機構への作用について調べた。顆粒細胞にパッチクランプ法を適用し、バゾプレシンの細胞外投与により抑制される顆粒細胞のCa2+電流がどのタイプのものか、各種チャネル阻害薬を用いて調べる。
(2) 一夫一婦型齧歯類の相反性シナプス伝達に対するバゾプレシンの作用
研究代表者が見出した、フェロモン記憶に重要な役割を果たしている副嗅球相反性シナプス伝達に対するバゾプレシンの抑制作用を多角的に捉えるため、来年度もプレリーハタネズミ（一夫一婦型齧歯類）を用いて上記相反性シナプス電流に対するバゾプレシンの作用を調べ、これまで得られたマウス（乱交型齧歯類）の結果と比較する。
具体的には、相反性シナプス伝達抑制に関与するバソプレシン受容体のサブタイプの同定や、オキシトシンの作用について調べる。
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| Causes of Carryover |
本研究の申請時点では、様々な機能分子候補それぞれに対する阻害薬および作動薬の購入を計画した。シナプス前機構にバソプレシンが影響を及ぼす機能分子として、初めに着目したCa2+チャネルに対して、実際にバソプレシンが効果を有することを見出した。この結果を受けて購入予定だった他の候補分子に対する阻害薬および作動薬を使用せずに済んだため、経費の節約に役立った。また、測定・解析機器類の一定頻度で生じる故障に備えた修理代・維持費を計上していたが、使用時に細心の注意を払って使用した為、今年度はその必要が余りなかったことも経費の節約につながった。また、新型コロナウイルスの感染拡大の影響で、参加予定だった複数の学会が全てWeb開催となり、旅費が不要になった。
以上の理由から次年度使用額が生じた。
・設備備品費として45万円を計上。電気生理測定・解析機器の購入代、修理代、維持費に用いる。薬品は、85万円を計上。バソプレッシン抗体、各種Ca2+チャネル阻害薬および作動薬など、を購入する。実験動物は、15万円を計上。購入費および飼育代として妥当かつ必要な額を使用する。実験器具は、10万円を計上。ガラス器具、スライス作成時の刃やメスの替え刃の購入に充てる。論文別刷りは、5万円を計上した。旅費等は15万円を計上した。次年度に開催される学会での研究成果発表に使用予定である。
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