2019 Fiscal Year Research-status Report

Inactivation of Cav1.2 channel by 2 molecules of calmodulin

Research Project

Project/Area Number	19K07303
Research Institution	Kagoshima University
Principal Investigator	蓑部悦子鹿児島大学, 医歯学域医学系, 講師 (00448581)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	Cav1.2チャネル / カルモジュリン / カルシウムチャネル / 不活性化 / Caイオン / パッチクランプ法 / プルダウン法
Outline of Annual Research Achievements	Cav1.2 チャネルは、細胞内Caイオンの濃度調節を行う。チャネルの活性化と不活性化にはカルモジュリンの作用が不可欠であることは明らかであるが、その分子機序については各論があり、統一されたモデルは提示されていない。我々は、パッチクランプ法やプルダウン法を用いて、Cav1.2チャネルに対するカルモジュリンの作用と結合部位との相関を調べてきた。その結果からは、カルモジュリンはチャネルにダイナミックな結合をしていること、細胞内Caイオン濃度の上昇に従って、その親和性を上げること、その結合部位はチャネルのアミノ(N)末端とカルボキシル(C)末端にあることが示唆された。また、チャネルの不活性化には、2パターンがあり、1分子のカルモジュリンがチャネルのN末端部とC末端部それぞれに架橋するように結合する様式と、2分子のカルモジュリンが同時にチャネルのC末端部に結合するというモデルを提唱した。このモデルを検証するために、1分子のカルモジュリンをチャネルのC末端部に繋いだチャネル変異体と更にそのN末端部位を欠損したチャネル変異体を作成し、パッチクランプ法を用いて、チャネルの不活性化を比較した。また、チャネルのN末端部とC末端部のペプチドを作成し、カルモジュリンを併せた3つのペプチド間での結合実験を、プルダウン法を用いて検討した。これまでに得られたデータから、チャネルの不活性化には2パターンあるという我々のモデルが支持された。さらに、2つのチャネル不活性化の様式が生理的に存在するとして、どちらが有意であるかを検討する。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 電気生理学実験に用いるプラスミドの調整に時間を要した。結合実験に用いるペプチド作成の方法検討に時間を要した。
Strategy for Future Research Activity	パッチクランプ法で得られた結果を解析し、不足したデータを取得する。結合実験に用いるペプチドを作成する上で生じた問題を解決し、計画されているプルダウン実験を行う。
Causes of Carryover	3月に参加を予定していた学会が開催中止（誌上開催）となったため、予定していた旅費が残った。残額は5月以降に予定しているペプチドの作成にかかる費用に充てる。