2019 Fiscal Year Research-status Report
蛍光イメージングによる創傷治癒過程の血管新生におけるペリサイトの役割の解明
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19K07307
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| Research Institution | Nippon Medical School |
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Principal Investigator |
弓削 進弥 日本医科大学, 先端医学研究所, 助教 (50723532)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
福原 茂朋 日本医科大学, 大学院医学研究科, 大学院教授 (70332880)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ペリサイト / 血管新生 / イメージング / 創傷治癒 / ゼブラフィッシュ / 内皮細胞 / 遺伝子組換え |
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| Outline of Annual Research Achievements |
正常組織の血管では、血管内皮細胞が内腔でシートを形成し、その周囲をペリサイトが被覆することで、安定な構造が維持される。しかし、創傷などで組織が虚血状態に陥ると、それを解消するために血管新生が誘導され、組織の修復が促され、その過程にペリサイトも関与する。私たちは、ゼブラフィッシュの蛍光生体イメージングにより、生きている成魚の皮膚の創傷治癒過程を解析し、同一個体を経時的に観察することで，創傷後に誘導される血管新生におけるペリサイトの役割の解明を試みてきた。
1年目では、血管とペリサイトを可視化でき、かつペリサイトを選択的に消失できる遺伝子組換えゼブラフィッシュを樹立し、その成魚の正常皮膚・創傷皮膚でペリサイトを消失させる実験を行った。ペリサイトを消失させ，3ヶ月以上にわたり経時的に観察したところ、正常皮膚では、血管を被覆するペリサイトが無くなっても、基本血管網には顕著な変化がないものの、新たなペリサイトはほとんど出現しなかった。いっぽうペリサイト消失魚の創傷皮膚では、皮膚血管は再生するが、ペリサイトはほとんど再生せず、修復後の血管網からさらに出芽による過剰な血管新生が起こった。なお、いずれの場合でも、魚の生存・摂食・行動に明らかな衰弱は観られなかった。これらのことより、ペリサイトは、血管の再生に関与するのではなく、再生した血管から過剰な血管新生が起こることを抑制する役割があることや、消失したペリサイトは再生するのが困難であることが示唆された。
皮膚血管でのペリサイトの機能をさらに調べるために、ペリサイトを消失させた皮膚血管の内皮細胞をフローサイトメトリーで単離し、ペリサイトが被覆している時としていない時での内皮細胞での遺伝子発現をRNAシークエンスで解析する実験系を確立し、現在その実験を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の基本となる遺伝子組換え魚の樹立は、以下の困難を除いて、うまくいった。血管とペリサイトを可視化できる魚はすでに樹立していたが、ペリサイトを選択的に消失できる魚に関しては、最初に用意した魚では標的ペリサイト全てを消失することができなかったため、改めて完全にペリサイトを消失できる魚を作製した。
正常皮膚と創傷皮膚でのペリサイトの消失の実験では、実験自体が機能したことに加えて、ペリサイトを消失した後も、魚を生かしたまま、経過観察を半年以上に渡ってできることが分かり、今後も本実験を日常的にできることを確信した。ただし、ペリサイト消失後の血管新生やペリサイト再生の変化は、数週間以上かかることが多く、1つ1つの実験に時間がかかるため、同時にできるだけ多くの個体を扱うなどの工夫を検討した。
皮膚血管でペリサイトを消失させた後の内皮細胞のフローサイトメトリーによる単離と、その後のRNAシークエンスに関しては、まず皮膚の血管内皮細胞を他の夾雑物をなるべく除いて単離する手法の確立を行ない、現在その手法により目的の内皮細胞を十分な数集めている段階である。
上述の実験と並行して、糖尿病に罹患させたゼブラフィッシュや若齢から老齢のゼブラフィッシュを用意し、病気や加齢の際の皮膚の血管とペリサイトの変化を解析できる実験系の樹立も試みてきた。これらは、私たちが確立したゼブラフィッシュの皮膚の血管とペリサイトの蛍光成体イメージングを駆使して取り組めるもので、本研究を将来さらに発展させる礎となる。
以上より、1年目の研究は、RNAシークエンス解析までは至らなかったものの、並行して行なった別の実験も含め、全体として順調に進んだ。生きた魚での皮膚の観察と皮膚内皮細胞の単離にかなりの時間がかかったが、それぞれの実験・解析を確実に行ないながら、研究を進められてきた。
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| Strategy for Future Research Activity |
2年目では、最初に、ペリサイトを消失させた正常皮膚、創傷皮膚から単離した内皮細胞のRNAシークエンス解析を行ない、ペリサイトが消失した皮膚血管の内皮細胞で遺伝子発現がどのように変化するかを解析する。
これまでの研究で、ゼブラフィッシュ成魚の皮膚では、ペリサイトが無くなっても、魚の生存・摂食・行動には問題が無く、基本血管網の維持、創傷血管の再生も起こるが、ペリサイトの再生はほとんど起こらず、いくらかの過剰な血管新生が起こることが分かった。そこで、内皮細胞がペリサイトの増殖を制御し、ペリサイトが過剰な血管新生を抑制しているという仮説を立て、ペリサイトを消失させた皮膚では、内皮細胞がペリサイトの増殖を調節する因子（PDGF-Bなど）を産生できず、増殖して再生できないペリサイトが血管を被覆できないために過剰な血管新生が起こると予想した。さらに、ペリサイトは内皮細胞を被覆するために細胞間接着に関与するNotchシグナルなどにも何か異常が起こって、ペリサイトが再生しても内皮細胞を被覆できないことも予想した。
そこで、RNAシークエンスの実験結果を考察し、まず、ペリサイトの増殖を制御している遺伝子、内皮細胞とペリサイトの細胞間接着に関わる遺伝子の発現の変化を解析する。次に、それらの遺伝子のシグナルを阻害したり促進したりすること、それらの遺伝子に変異を加えてみることなどを行ない、皮膚におけるペリサイトの内皮細胞への作用機構を検証する。
2年目では、創傷治癒の血管新生におけるペリサイトの役割をできるだけ明らかにしていきたい。
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| Causes of Carryover |
1年目では、それまでに研究室で用意してあった機器、試薬、消耗品、遺伝子組換え魚を用いて実験できることが多かったこと、さらに2019年12月～2月に、研究室が学内で他の校舎に引越しを行なったために3ヶ月間大きな実験をできなかったこと、予定していたRNAシークエンス解析を2年目に行うことになったことなどにより、予定よりもかなり少ない研究費を使用した。
2年目では、RNAシークエンス解析を行なうことと、その後のさまざまな実験を行うことに多くの研究費を用いるため、1年目で残った研究費もそれらに充てる計画である。
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| Remarks |
本研究は、研究協力者の石井智裕（2019年5月より研究室に加わった）とともに遂行してきている。
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[Presentation] Vascular intraluminal pressure load inhibits directed endothelial cell migration and branch elongation2019
Author(s)
Nishiyama, K., Yuge, S., Arima, Y., Hanada, Y., Hanada, S., Ryuji Yokokawa, R., Miura, T., and Fukuhara, S.
Organizer
Angiogenesis in Gordon Research Conference 2019
Int'l Joint Research
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