2021 Fiscal Year Research-status Report

遺伝コード拡張法を用いたアセチルコリン受容体の構造変化の研究

Research Project

Project/Area Number	19K07334
Research Institution	Osaka Medical and Pharmaceutical University
Principal Investigator	坂田宗平大阪医科薬科大学, 医学部, 准教授 (40528006)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2023-03-31
Keywords	アセチルコリン受容体 / パンクロニウム / ゼブラフィッシュ / 阻害剤
Outline of Annual Research Achievements	ニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)は神経筋接合部において筋側に発現し、運動神経の興奮に伴いシナプス間隙に放出されるアセチルコリンを受容する。nAChRはリガンド作動性のイオンチャネルであり、nAChRが開口すると筋が脱分極し活動電位が形成される。ゼブラフィッシュの速筋では、イプシロンサブユニットを含むタイプのnAChR（以下、イプシロンタイプと呼ぶ）が発現しており、遅筋ではデルタサブユニットを含むタイプ（以下、デルタタイプと呼ぶ）が発現していることが報告されているが、これらの２つタイプで開口メカニズムが異なる可能性を考えている。nAChRの開口を修飾する分子として多くの薬剤が知られているが、これまでの研究で阻害剤の一つであるパンクロニウムが２つのnAChRに対して、それぞれアフィニティが異なることを見出した。アフィニティが異なるメカニズムを調べるため、イプシロンタイプとデルタタイプの受容体の間でキメラタンパク質を作成した。nAChRの構造は大まかにリガンド結合部位のある細胞外部分、膜貫通部分、細胞内部分の３つの部分に分けることができる。まず、細胞外部分がイプシロンタイプでそれ以外の部分をデルタタイプで構成されるnAChRを作成したところ、パンクロニウムのアフィニティはデルタタイプに近い値であった。さらに膜貫通部分もイプシロンタイプに置換してもデルタタイプに近いアフィニティであった。これは細胞内部分がパンクロニウムに対するアフィニティを決めていること示している。これまでパンクロニウムは細胞外のリガンド結合サイトにアセチルコリンと拮抗的に作用すると考えられていたが、実際にはそうではなくリガンド結合サイトを持たない細胞内部分がアフィニティに強く関与していることを明らかにした。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason nAChRの阻害剤であるパンクロニウムは、これまでアセチルコリンと拮抗して作用すると考えられてきたが、新たな可能性として細胞内部分がアフィニティに関与していることを明らかにした。これは大きな成果であると考えており、おおむね順調に進展しているとした。
Strategy for Future Research Activity	本研究により示したデルタタイプとイプシロンタイプに対するパンクロニウムのアフィニティの相違はゼブラフィッシュのnAChRに対するものである。ヒトのnAChRでも同様の現象がみられるかどうか、パッチクランプ法により確かめることを計画している。さらに遺伝コード拡張法を用いてデルタタイプとイプシロンタイプ、それぞれの開口メカニズムを明らかにする実験を行う予定である。
Causes of Carryover	これまでにゼブラフィッシュのnAChRにおけるパンクロニウムに対するアフィニティの相違を明らかにした。しかしヒトのnAChRについての実験や遺伝コード拡張法を用いた実験を行うに至らなかっため期間延長を行い、研究費を次年度に使用することにした。パッチクランプ法、および遺伝コード拡張法を行うための機器や消耗品に使用する予定である。