2020 Fiscal Year Research-status Report
血小板の産業的生産に向けた巨核球成熟のシングルセルアプローチ
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19K07344
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
曽根 正光 北海道大学, 低温科学研究所, 助教 (90599771)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 血小板 / iPS細胞 / RNA-seq / シングルセル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
血小板製剤は、事故による外傷や外科手術による出血の迅速な止血や血液疾患により減少した血小板の補充など多様な局面において必要不可欠な血液製剤である。しかし、我が国における少子高齢化の急速な進行により、献血に依存する血液製剤は、将来深刻な供給不足に陥る可能性がある。中でも血小板製剤は血液採取から輸血までの使用期限が4日間と短く、備蓄が不可能なため供給が不安定化する恐れが大きい。この問題に対処するため、私たちはiPS細胞（人工多能性幹細胞）技術に基づく血小板の工業的生産を目指している。2014年にiPS細胞から血小板前駆細胞である巨核球を誘導し、Doxという薬剤によって増殖を促進遺伝子を発現させることのできるimMKCL細胞株が樹立された。
imMKCLはDox存在下で無限に増殖でき、Doxを除去すると分化を開始し、多核化、細胞体サイズの増大、細胞膜の肥大、proplatelet（胞体突起）の形成という一連の成熟過程をわずか5日で完了し、血小板を産生するというマスターストック細胞としての優れた性質を有する。しかしながら、巨核球分化の最終段階であるproplateletの形成が見られるのは、Dox除去後imMKCL全体の10%未満で、残りの細胞は血小板を生み出さず生産効率の低下を招いている。そこで、本研究では、血小板産生プロセスの最終段階であるproplatelet形成という形態的特徴を信頼のおける指標として、最新の細胞分取技術を用いて、シングルセルレベルでの網羅的発現比較解析を行うことでこの問題をクリアし、血小板放出のメカニズムを明らかにすることを目標とする。
当該年度においてシングルセルレベルの解析に加えて網羅的代謝解析を行い、巨核球成熟の新たな制御因子の候補を同定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前年度、マイクロラフトと呼ばれる構造が敷き詰められたQIAscoutという装置にDox除去後3日目のimMKCLを低密度で播種した。翌日、顕微鏡下で、proplatelet陽性あるいは陰性の１細胞が接着したマイクロラフトを分取し、次世代シーケンサーで発現比較解析を行った。その結果、proplatelet形成に重要な役割を果たす遺伝子の候補が得られた。
本年度はそれらの遺伝子がコードするタンパク質の機能を薬剤により模倣することを試みた。現在のところ、まだ決定的な結果が得られておらず、追試が必要な状況である。また、シングルセル解析と並行して、Dox除去後のimMKCL細胞集団についてLC-MSを用いた代謝物質の解析を行った。その結果、imMKCLの成熟と血小板放出に重要な役割を果たす代謝経路の候補が得られた。
従って、シングルセル解析及び網羅的代謝解析により得られた候補因子がimMKCLの成熟に与える影響を調べることで、新規の血小板放出メカニズムを明らかにできると期待されることから進捗状況は概ね順調と考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
シングルセル解析と網羅的代謝解析により同定された、巨核球成熟に重要な役割を果たすと予想される遺伝的経路について、薬剤や遺伝子導入により活性化を行い、imMKCLによる血小板産生の効率を上昇させることを目指す。また、本研究で得られた成果を、近年人工血小板の産業化を目指して開発されたバイオリアクターによる血小板生産法と組み合わせることで更なる生産性の改善を図る。
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Research Products
(1 results)
