2020 Fiscal Year Research-status Report
家族性アミロイドポリニューロパチーのエクソンヒト化モデルを用いた遺伝子治療実験
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19K07354
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
李 正花 熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 客員准教授 (80398239)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山村 研一 熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 客員教授 (90115197)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 家族性アミロイドポリニューロパチー / トランスサイレチン / 優性遺伝病 / CRSIPR/Cas9 / 遺伝子治療 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
家族性アミロイドポリニューロパチー(FAP)は、トランスサイレチン(TTR)遺伝子の点突然変異により引き起こされる典型的なヒト優性遺伝病である。マウスTTR遺伝子のエクソンだけをヒトTTRエクソンでヒト化したFAPモデルマウスを用い、その肝臓内でヒト変異TTR遺伝子を破壊し、遺伝子治療が可能かどうかを検証するのが目的である。FAP患者に対する過去の肝臓移植による治療では、移植後の正常な肝臓から産生される野生型TTRが、意外にもアミロイド沈着を起こし、十分な治療効果が上がらないことが分かった。そこで、遺伝子治療では、変異遺伝子だけでなく、野生型遺伝子も含めて標的とし、血中TTRレベルを20%以下にすることが治療目標となっている。このため、実験計画としては、当初予定したTtrhV30exon/hM30exonではなく、TtrhV30exon/hV30exonマウスを用いてCRISPR/Cas9法により生体肝臓内でヒトTTR遺伝子の破壊を行い、治療効果を確認する。本年度は、TtrhV30exon/hM30exonの交配によりTtrhM30exon/hM30exonの作製を行っている。また、予備実験としてHydrodynamic tail vein injection (HDTV) 用に調整したプラスミド (pLIVE-fresnoRFP)をHDTV用の試薬 (TransIT-QR Hydrodynamic Delivery Solution, TaKaRa Bio, Cat No. V5340) のプロトコールに従い尾静脈より注射した。24時間後にマウスの肝臓を単離し蛍光を観察したところ、ほぼすべての肝細胞で蛍光が観察され、HDTI法を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
（１）Ttr<hV30exon/hV30exon>の卵子と精子を用いての体外受精により、多数のTtr<hV30exon/hV30exon>の受精卵を得た。この受精卵を用い、CRSPR/Cas9法で、Ttr<hV30exon/hM30exon>マウスを作製した。現在、交配によりTtrh<M30exon/hM30exon>マウスを得ているところである。
（２）遺伝子治療実験には、Ttr<hV30exon/hV30exon>マウスを使用する予定であり、増産中である。
（３）予備実験としてHydrodynamic tail vein injection (HDTV) 法で、生体肝臓への遺伝子導入効率を検討した。このためpLIVE:Vector/lacZ Control Vector Kitを購入し、この中のlacZをfresnoRFPに組み換えたpLIVE-fresnoRFPを構築した。注入量は1 ml/10 g body weight とし、プラスミド溶液50μl (50μg含有)をTransIT-QR Hydrodynamic Delivery Solutionと混合し、尾静脈より７秒以内に注射した。24時間後にマウスの肝臓を単離し蛍光を観察したところ、ほぼすべての肝細胞で蛍光が観察され、HDTV法の確立に成功した。
（４）AAVベクターを用いることを想定し、SaCas9でATG付近を切断できるかどうかを検討した。５種類のcrRNAを作製し、tracrRNA, Cas9 mRNA, single strand DNA (ssDNA)を用いてin vitroで切断活性を調べたところ、Sa-ex2-T2が一番良いことがわかった。この配列をpAAV-Guide-it-1 vectorに組み込みpAAV-Sa-ex2-T2を作製した。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヒト患者のほとんどはヘテロ接合体TtrhVal30/hMet30である。しかし、遺伝子治療においては、変異遺伝子のみならず野生型遺伝子も破壊し、血中のTTR量を80%低下させる必要がある。このため、モデルを用いての遺伝子治療実験では、TtrhV30exon/hM30exonマウスを使用する必要がなく、初年度で得られたTtrhV30exon/hV30exonを用いることとした。破壊場所としては、なるべく5’側にgRNAを設定すれば良く、切断効率の良い部位を選択すれば良い。マウスでこのgRNAが効率よくマウス生体の肝臓でTTR遺伝子を破壊できるかどうかを検討するため、HDTV法をまず確立した。ヒトにおいては、このHDTV法は負担がかかりすぎるため使用できず、adeno-associated virus (AAV)ベクター等を用いる必要がある。そこで、今後はAAVベクターの検討を開始する。そのためには従来用いられているSpCas9ではなく、１kbほど短いSaCas9用いることにより、AAVベクター内にSaCas9とgRNAを両方挿入できる。SaCas9w用いてTTR遺伝子のexon2付近を効率よく切断できることがわかった。
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| Causes of Carryover |
残額が45円と金額が小さすぎ、次年度に繰越した
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