2021 Fiscal Year Annual Research Report

家族性アミロイドポリニューロパチーのエクソンヒト化モデルを用いた遺伝子治療実験

Research Project

Project/Area Number	19K07354
Research Institution	Kumamoto University
Principal Investigator	李正花熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 客員准教授 (80398239)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	山村研一熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 客員教授 (90115197)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	家族性アミロイドポリニューロパチー / トランスサイレチン / 優性遺伝病 / CRSIPR/Cas9 / 遺伝子治療
Outline of Annual Research Achievements	家族性アミロイドポリニューロパチー(FAP)は、トランスサイレチン(TTR)遺伝子の点突然変異により引き起こされる典型的なヒト優性遺伝病である。マウスTTR遺伝子のエクソンだけをヒトTTRエクソンでヒト化したFAPモデルマウスを用い、その肝臓内でヒト変異TTR遺伝子を破壊し、遺伝子治療が可能かどうかを検証するのが目的である。FAP患者に対する過去の肝臓移植による治療では、移植後の正常な肝臓から産生される野生型TTRが、意外にもアミロイド沈着を起こし、十分な治療効果が上がらないことが分かった。そこで、遺伝子治療では、変異遺伝子だけでなく、野生型遺伝子も含めて標的とし、血中TTRレベルを20%以下にすることが治療目標となっている。本年度は、TtrhV30exon/hM30exonの交配により十分な数のTtrhM30exon/hM30exonを作製した。一方、ヒトTTR遺伝子を破壊するため、SaCas9を含む市販のAAV-Guide-it-1 vectorを元に5種類のgRNAを組み込んだベクターを作製し、もっとも高い活性を示すgRNA ex2-T3 (GAC ACC TGG GAG CCA TTT GCC T [CTGGGT]) ([]内はPAM配列)を組み込んだAAV-gRNA-TTRex2-T3--SaCas9を選別した。そして、この50μg Hydrodynamic tail vein injection法を用いてプラスミドのままTtrhM30exon/hM30exonに注入した。その結果、8匹中3匹で約50％の低下が認められた。AAV粒子を作製し、注入する予定であったが、研究費がなくなり実施できなかった。