CG-NAP function in ciliogenesis through regulation of centriolar satellite formation

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07356
• Research Institution: Teikyo Heisei University
• Principal Investigator: 金 憲誠 帝京平成大学, 薬学部, 講師 (70469899)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松尾 和彦 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (70599753) ; 高橋 美樹子 帝京平成大学, 薬学部, 教授 (90324938)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 一次繊毛 / 中心小体サテライト / ゴルジ体 / ゴルジ微小管

Outline of Annual Research Achievements

当該年度はCG-NAPが一次繊毛の形成に関わる中心小体サテライト（CS）の細胞内局在をどのように制御しているのかを重点的に解析した。
野生型RPE-1細胞とCG-NAP KO細胞でのCS局在を詳細に比較したところ、野生型細胞では中心体とゴルジ体由来の両微小管上にCSの主成分であるPCM1が局在していたのに対し、ゴルジ微小管を形成できないCG-NAP KO細胞では中心体微小管上にのみ局在していた。そこで、ゴルジ微小管の形成のみ回復可能な欠失変異体1-3568（PCM1とは結合できない）をKO細胞に発現させたところ、ゴルジ微小管上へのPCM1の局在は回復したことから、PCM1はCG-NAP依存的に形成されたゴルジ微小管上にロードされることがわかった。また、野生型細胞をノコダゾール処理すると、ほとんど全てのPCM1は細胞質全体に散在したが、KO細胞では同処理によってPCM1をはじめCEP290、MIB1などのCSコンポーネントの中心体周辺への蓄積が見られた。これらはいずれもRab8の中心体へのターゲティングに必要な分子であることから、CG-NAPまたはCG-NAP依存的に形成されたゴルジ微小管は、CSの中心体微小管上へのローディングとそれに伴う中心体への過剰な集積（またはCSの異常なアグリゲーション形成）を抑制しているのではないかと考えられた。そのようなCG-NAP依存的なCSの輸送調節が正しいRab8のターゲティングひいては一次繊毛の形成に必要であると考えられた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでに得られた実験結果をまとめた論文を投稿中であるため、研究課題の進捗状況は概ね順調であると考えている。
一方、当該年度の計画では、研究分担者である松尾和彦（京都府立医大・助教）と協力し、CG-NAP KO細胞で繊毛小胞のdistal appendageへの融合が阻害されているかを電子顕微鏡によって解析する予定であった。しかしながら新型コロナウイルス感染症のパンデミックの影響により、スケジュール調整等が上手くいかなかったため当該計画に関しては最終年度に行うこととした。

Strategy for Future Research Activity

昨年度の研究結果より、CG-NAP KO細胞では一次繊毛の形成において抑制的な働きを持つE3リガーゼMIB1がPCM1依存的に中心体周辺へ過剰蓄積することによって、その下流因子でありRab8のターゲティングに必須なTalpid3の分解が引き起こされているのではないかと推測した。しかしながら、KO細胞でのTalpid3の量は野生型とほとんど変わらなかったため、KO細胞での一次繊毛の形成不全は他の要因によるものと推測される。今後は「CG-NAPがどのようにしてRab8のターゲティングを制御するのか」について、次のような計画に沿って研究を行う予定である。
①研究分担者である松尾和彦（京都府立医大・助教）と協力し、CG-NAP KO細胞で繊毛小胞のdistal appendageへの融合が阻害されているかを電子顕微鏡解析によって明らかする。②CG-NAPとRab8の直接的な相互作用は見られなかったことから、Rab8のターゲティングに関わる他の分子と関係している可能性が考えられる。その候補分子の一つであるGDIとCG-NAPの関係について調べ、Rab8への影響を明らかにする。③CG-NAP KO細胞ではPCM1依存的にCSそのものが中心体周辺へ集積していると考えられる。近年、一次繊毛の形成にはCSコンポーネントであるOFD1がオートファジーによって分解される必要があるということが報告され、一次繊毛形成とオートファジーの分子間クロストークが明らかにされつつある。そこで、CG-NAPのオートファジーへの関与という側面からも検討する。以上の計画によってCG-NAPによるCSの制御を通じた一次繊毛形成機構のモデルを提唱する。

Causes of Carryover

当該年度末の予算支出の調節が上手く行かなかったため生じた残額であり、次年度の試薬、抗体購入へあてる。