2021 Fiscal Year Research-status Report
CG-NAP function in ciliogenesis through regulation of centriolar satellite formation
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19K07356
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| Research Institution | Teikyo Heisei University |
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Principal Investigator |
金 憲誠 帝京平成大学, 薬学部, 講師 (70469899)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松尾 和彦 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (70599753)
高橋 美樹子 帝京平成大学, 薬学部, 教授 (90324938)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 一次繊毛 / ゴルジ体 / 中心体 / 中心小体サテライト |
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| Outline of Annual Research Achievements |
当該年度は引き続きCG-NAPが中心小体サテライト（CS）の細胞内局在をどのように制御しているのかを重点的に解析した。はじめに、種々のPCM1欠失変異体を作製し、CG-NAP結合領域の特定を行った。その結果、734-1101アミノ酸領域にまで絞り込んだ。この欠失変異体を過剰発現すると、ゴルジ微小管の形成へほとんど影響を与えず、内在性PCM1の中心体とゴルジ体への集積および一次繊毛の形成を抑制したことから、PCM1とCG-NAPの結合を特異的に阻害していると考えられた。これにより一次繊毛形成においてPCM1とCG-NAPの結合が必要であることが証明できた。また、野生型細胞でPCM1は微小管の再形成過程にゴルジ微小管上にロードされるのに対し、CG-NAP KO細胞では中心体微小管にのみ局在することも見出した。したがってCG-NAPはPCM1に対して直接、またはゴルジ微小管を介して作用することで、PCM1の中心体近傍への集積を抑制している可能性が考えられた。また、このようなCG-NAP依存的なPCM1の局在機構はマウスC2C12細胞やHela細胞などの多種細胞においても保存されていることもわかった。
さらには、CG-NAP KO細胞とオートファジーの関係についても解析した。CG-NAP KO細胞では血清存在下においてオートファゴソームの過剰な形成が観察されたことに加えてオートファジー活性化の指標となるLC3-IIの産生とオートファジーの基質であるp62の過剰な分解が観察された。この結果からCG-NAP KO細胞ではオートファジーが亢進している可能性も考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
これまでの研究結果をまとめて投稿したがrejectとなったため、さらなるデータを揃えるため追加実験を行い、データの再検証を行なっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は「CG-NAPがどのようにして中心小体サテライトを介してRab8のターゲティングを制御するのか」という問いについて、次のような計画に沿って研究を行う予定である。
①上記PCM1欠失変異体をCG-NAPとの結合のみを阻害するツールとして使用することで、微小管への影響を排除した条件下で、両者の作用の生理的意義について検証する。具体的には、Rab11、Rabin8、Rab8に対してCG-NAPとPCM1の結合がどのように関わっているのかを中心に調べることで、Rab8のターゲティング制御機構を明らかにする。
②オートファジーによる調節の可能性を検証する。CG-NAP KO細胞で見られたオートファジーの亢進によってRab8のターゲティングに関わる分子にどのような影響をもたらしているかを調べることで、この可能性を検証する。例えば、Rab8やその上流因子、または中心小体サテライトの構成因子などが過剰に分解されているのかを調べる。
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| Causes of Carryover |
CG-NAPによるRab8のターゲティングにオートファジーの関与を示唆するデータが得られたため、オートファジーとの関係を解析する必要が生じた。また、当該研究で提案したモデルが細胞種依存的である可能性を示唆するデータも得られた。次年度にこれらの仮説の検証を行ったうえでデータに加える予定である。それに伴い、オートファゴソームを可視化するためのプラスミドや各種抗体、細胞株、解析に必要な消耗品等を購入する予定である。
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