2019 Fiscal Year Research-status Report
敗血症増悪化に関わる遊離ヘムによる消化管上皮バリア機能障害機構の解明
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19K07359
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| Research Institution | Yasuda Women's University |
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Principal Investigator |
赤木 玲子 安田女子大学, 薬学部, 教授 (50150967)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宮本 崇史 筑波大学, 医学医療系, 助教 (50740346)
井上 幸江 山陽小野田市立山口東京理科大学, 薬学部, 教授 (60159978)
北澤 健生 安田女子大学, 薬学部, 准教授 (70791490)
久保 貴紀 安田女子大学, 薬学部, 講師 (90435751)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | タイトジャンクション / バリア障害 / 遊離ヘム / ヘムオキシゲナーゼ-1 / 一酸化炭素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、消化管の出血に起因する遊離ヘム濃度の上昇がもたらすバリア障害の発症機序を解明することが目的である。2019年度に実施した研究成果を以下の2点にまとめた。
1.ヘム結合TJAC構成タンパク質の網羅的探索
以下の3条件で培養したヒト結腸癌由来細胞Caco-2より、ヘム-アガロースを用いてヘム特異的結合タンパク質を分離精製した。①無処置、②ヘム生合成前駆体5-aminolevulinateを添加、③ヘム生合成阻害剤succinylacetoneを添加、の細胞から各々抽出したタンパク質をSDS-PAGEにより分離し、①に比べて②で減少、③で増加する20～100kDの複数のバンドを対象として、タイトジャンクションに結合するヘム結合タンパク質の候補としてMALDI-TOF MSを用いた解析を行うべく準備を進めている。
2.HO-1によるバリア機能修復メカニズムの解明
ヘム分解系律速酵素HO-1によるバリア機能修復メカニズムを解明する目的で、CRISPR-Cas9法でHO-1をノックアウトしたCaco-2 (KO)を作成しクローン化した。この細胞は野生型に比べてヘムによるバリア障害が増悪化することをTrasepithelial electrical resistanceを測定することにより明らかにした。また、バリア障害を抑制することが報告されているグルタミンは、Caco-2 (KO)では効果が認められなかった。このことは、グルタミンがHO-1誘導を介してバリアを保護している可能性を示唆している。本研究の仮説である高親和性ヘム結合物質COによるバリア調節機構を解明するためにCO-releasing molecules (CORMs)を用いた検討を開始した。CORM2添加により、ヘムによるバリア障害からの回復が有意に改善されるという結果を得ているが、他のCORMsによる検討も準備中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題の核心的な問いである『タイトジャンクションタンパク質と結合したヘムは、HO-1によって分解された遊離ヘム由来のCOと配位することでTJACから解離され、その結果、バリア機能が修復されるのではないか？』は、Caco-2 (KO)細胞を樹立し、ヘムによるバリア障害が増悪化することから一部裏付けられたと考えている。さらに、ヘム結合タンパク質の分離同定についても準備は整っているが、この度の緊急事態宣言の影響で予定が少し遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
1: ヘム結合TJAC構成タンパク質の網羅的探索
ヒト消化管上皮を再現したCaco-2細胞からタンパク質を抽出し、Heme conjugated magnetic beadsに通してヘム結合性タンパク質を吸着させ、ポルフィリン環をもつヘムの前駆体であるプロトポルフィリンIX (PPIX)で洗浄した後、ヘムで溶出されるタンパク質を分離する。その後、分離されたタンパク質の質量分析(MALDI-TOF MS)を行うことで、ヘム特異的結合タンパク質の同定を行う。同定したヘム結合TJAC構成タンパク質とヘムの結合については、Biacoreを用いて、結合・解離のスピードや結合強度などについて、詳細な検討を行う。
2: HO-1によるバリア機能修復メカニズムの時空間的な解析
ヘムによるHO-1の発現誘導に必要な転写因子の結合部位を除去したCaco-2細胞を樹立し、ヘムの添加によってHO-1の誘導がかからないようにする。その後、直交的に作用する2つのタンパク質発現制御システムによって、外因的に導入したHO-1とヘム結合タンパク質の発現レベルを任意に操作できるようにする。これにより、ヘムとHO-1反応産物COについて様々なシチュエーションを創り出すことでヘムとの親和性を定量し、HO-1によるバリア機能修復におけるCOの重要性を検討する。
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| Causes of Carryover |
本研究を遂行する際、コロナウイルス禍の影響で一部研究が遅延したため、83,020円の次年度への繰り越しを行なった。繰り越し分に関しては、今年度分と合わせて研究を遂行するために使用する。
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Research Products
(10 results)
