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2020 Fiscal Year Research-status Report

敗血症増悪化に関わる遊離ヘムによる消化管上皮バリア機能障害機構の解明

Research Project

Project/Area Number 19K07359
Research InstitutionYasuda Women's University

Principal Investigator

赤木 玲子  安田女子大学, 薬学部, 教授 (50150967)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 宮本 崇史  筑波大学, 医学医療系, 助教 (50740346)
井上 幸江  山陽小野田市立山口東京理科大学, 薬学部, 教授 (60159978)
北澤 健生  安田女子大学, 薬学部, 准教授 (70791490)
久保 貴紀  安田女子大学, 薬学部, 講師 (90435751)
Project Period (FY) 2019-04-01 – 2022-03-31
Keywordsタイトジャンクション / バリア障害 / 遊離ヘム / ヘムオキシゲナーゼ-1 (HO-1) / 一酸化炭素
Outline of Annual Research Achievements

本研究は、消化管の出血に起因する遊離ヘム濃度の上昇がもたらすバリア障害の発症機序を解明することが目的である。2020年度に実施した研究成果を以下の2点にまとめた。
1. HO-1によるバリア機能修復メカニズムの解明
現在までに本研究の仮説である「高親和性ヘム結合物質COによるバリア調節機構」を解明するために、ヒト結腸癌細胞Caco-2にCO-releasing molecules (CORMs)を添加したところ、ヘムによるバリア障害からの回復が改善される結果を得ている。ヘム分解系律速酵素HOは生体内で唯一のCO産生系であることを踏まえて、CRISPR-Cas9法でHO-1をノックアウトしたCaco-2-HO-1KO を作成した。複数のクローンを用いてTrasepithelial electrical resistanceを測定したところ、ヘムによるバリア障害レベルが異なる結果が得られたため、ヘム添加によるHO-1誘導の消失を確認することにより再クローン化した。
2. ヘム結合TJAC構成タンパク質の網羅的探索
ヘム-アガロースを用いてCaco-2よりヘム特異的結合タンパク質を抽出し、SDS-PAGEにより分画した。無処置の細胞に比べてヘム生合成前駆体5-aminolevulinate (ALA)を添加を添加して培養した細胞で減少し、ヘム生合成阻害剤succinylacetone (SA)を添加して培養した細胞で増加する複数のバンドが得られたので、バリア機能の調節に関与するヘム結合タンパク質の候補としてMALDI-TOF MSを用いた解析を開始した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究課題の核心的な問いである『タイトジャンクションタンパク質と結合したヘムは、HO-1によって分解された遊離ヘム由来のCOと配位することでTJACから解離され、その結果、バリア機能が修復されるのではないか?』は、Caco-2にヘム生合成前駆体ALAを添加することによりヘム添加と同様にバリア機能の著明な低下が認められたことにより、細胞内遊離ヘムがタイトジャンクションタンパク質と結合してバリア障害を起こすことは裏付けられたと考えている。2020年度までに樹立したCaco-2-HO-1KO細胞を用いて、遊離ヘムによるバリア障害の動態を野生型と比較検討しているところである。
ヘム結合タンパク質の分離同定については、候補となるタンパク質の絞り込み等の準備は整ったところであるが、この度のコロナ禍の影響を受けて、試薬の納入が遅れるなどの影響で予定が遅れている。

Strategy for Future Research Activity

2020年度までの研究により、Caco-2細胞から抽出したタンパク質のうち、ヘム-アガロースを用いてヘム結合性タンパク質を吸着させ、ヘムの前駆体であるプロトポルフィリンIX (PPIX)で非特異的なタンパク質を洗浄した後、ヘムで溶出されるタンパク質を分離する条件検討を行った。今後、複数の候補タンパク質を質量分析(MALDI-TOF MS)を用いて解析することで、ヘム特異的結合タンパク質の同定を行う。同定したヘム結合TJAC構成タンパク質とヘムの結合については、Biacoreを用いて、結合・解離のスピードや結合強度などについて、詳細な検討を行う予定である。標的タンパク質が同定できれば、そのノックアウトCaco-2細胞を作成し、ヘムによるバリア障害の動態をCaco-2-HO-1KO細胞と比較検討する。さらに、ヘムによるHO-1の発現誘導に必要な転写因子の結合部位を除去したCaco-2細胞を樹立し、ヘムの添加によってHO-1の誘導がかからないようにする。これにより、ヘムとHO-1反応産物COについてヘムとの親和性を定量化し、HO-1によるバリア機能修復におけるCOの重要性を検討する予定である。

  • Research Products

    (9 results)

All 2021 2020

All Journal Article (2 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 2 results) Presentation (7 results)

  • [Journal Article] Role of heme oxygenase-1 in human placenta on iron supply to fetus2021

    • Author(s)
      Inoue Rikako、Irie Yasuyuki、Akagi Reiko
    • Journal Title

      Placenta

      Volume: 103 Pages: 53~58

    • DOI

      10.1016/j.placenta.2020.09.065

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Visualization of the Redox Status of Cytosolic Glutathione Using the Organelle- and Cytoskeleton-Targeted Redox Sensors2020

    • Author(s)
      Hatori, Y., Kubo, T., Sato, Y., Inouye, S., Akagi, R., Seyama, T.
    • Journal Title

      Antioxidants (Basel)

      Volume: 9 Pages: 1-14

    • DOI

      10.3390/antiox9020129

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Presentation] ヒト由来培養細胞における分化後のヘムオキシゲナーゼ-1の熱ショック応答機構の解明2021

    • Author(s)
      佃美穂、鍵平光希、村上千穂、赤木玲子
    • Organizer
      日本薬学会第141回年会
  • [Presentation] 希釈培地を用いたシデロフォア産生微生物の培養・検出法の開発2021

    • Author(s)
      清水弘美、村上千穂、三上あい、玉岡聖菜、小佛さとみ、木村浩康、赤木玲子
    • Organizer
      日本薬学会第141回年会
  • [Presentation] 温熱ストレス負荷によるヘムオキシゲナーゼ‐1誘導メカニズム~HSF1, NRF2, BACH1の役割~2020

    • Author(s)
      赤木玲子、久保貴紀、村上千穂、井上幸江
    • Organizer
      第61回日本生化学会中国・四国支部例会
  • [Presentation] 腸上皮バリア障害におけるヘム代謝の影響2020

    • Author(s)
      松富 香名子、井上 幸江、村上 千穂、赤木 玲子
    • Organizer
      第61回日本生化学会中国・四国支部例会
  • [Presentation] Heme oxygenase-1による消化管上皮バリア機能の調節機構2020

    • Author(s)
      松富 香名子、木村 希、村上 千穂、井上 幸江、赤木 玲子
    • Organizer
      第93回日本生化学会大会
  • [Presentation] マウス由来肝癌細胞におけるHO-1遺伝子の熱ショック応答機構の解明2020

    • Author(s)
      赤木玲子、佃美穂、久保貴紀、村上千穂、井上幸江
    • Organizer
      第59回日本薬学会・日本薬剤師会・日本病院薬剤師会中国四国支部学術大会
  • [Presentation] Alteration of the HO-1 induction in an HL60 cell line by differentiation2020

    • Author(s)
      Sachiye Inouye, Takuya Iyoda, Naoyuki Okita, Takafumi Miyamoto, Yoichi Mizukami, Reiko Akagi
    • Organizer
      第43回日本分子生物学会年会

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Published: 2021-12-27  

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