2019 Fiscal Year Research-status Report
Development of locus-specific single cell analysis of chromatin modifications in tissue
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19K07372
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
西山 晃 横浜市立大学, 医学部, 准教授 (80589664)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | エピゲノム / 単一細胞解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
令和元年度においては、当初の計画を変更して、まずマウス脾臓組織と細胞株で解析対象となるゲノム領域を選択するために、バイオインフォマティクスによるエピゲノム解析を行った。このエピゲノム解析では、本研究で用いる予定の細胞株ならびにマウス脾臓から分離した血球成熟細胞について、遠位エンハンサーや遺伝子の活性化マーカーであるアセチル化ヒストンH3K27（H3K27ac）に対する抗体を用いたクロマチン免疫沈降－シーケンス法のデータを用いた。この解析によって、ゲノムワイドで活性化エンハンサーの分布が評価できた。さらに遺伝子発現データも解析に加えることで、血球成熟細胞に特異的に発現する遺伝子の近傍に存在する活性化エンハンサーで、かつ細胞株とマウス脾臓由来の血球成熟細胞とで共通のエンハンサーが選択できた。これらのゲノム領域を解析の対象として、今後の解析を進める予定である。加えて、当初から初年度に計画していたdCas9安定発現細胞を用いて本研究の基礎となるデータの収集を進めた。まず転写因子IRF8依存的に単球分化を誘導する血球前駆細胞株について、dCas9の恒常性発現を試みた。初めにレトロウイルスベクターによる導入を試みたところ、dCas9が長期間安定して発現する細胞を得るのは困難であった。これは、dCas9遺伝子が4 kb以上と長大であるため、長期間の安定発現が困難になったと考えられた。これを解決するため、レンチウイルスベクターによるdCas9の導入を行なった結果、長期間のdCas9の安定発現を達成することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
当初の計画とは異なり、令和元年度はまずマウス脾臓組織と本研究で使用する細胞株で、アセチル化ヒストンH3K27のクロマチン免疫沈降－シーケンス法のデータを用いたエピゲノム解析を行った。この計画は当初の計画にはなかったが、１）マウス脾臓組織と細胞株の双方で共通して同じヒストン修飾が存在するゲノム領域で解析を行なった方がより確実に研究を遂行できること、２）マウス組織での解析対象となるゲノム領域については申請段階では明記しておらず、研究早期で解析対象となるゲノム領域を決定した方が良いと考えたため、の二つの理由からである。申請時からの計画の不備であったため、自己評価は「遅れている。（Delayed）」とした。このエピゲノム解析によって、血球成熟細胞に特異的に発現する遺伝子の近傍に存在して、かつ細胞株とマウス脾臓由来の血球成熟細胞とで共通のエンハンサーを選択することができた。これらのゲノム領域を解析の対象として、今後の解析を進める予定である。加えて、当初から初年度に計画していたdCas9安定発現細胞を用いて本研究の基礎となるデータの収集を進めた。まず転写因子IRF8依存的に単球分化を誘導する血球前駆細胞株について、dCas9の恒常性発現を試みた。初めにレトロウイルスベクターによる導入を試みたが、dCas9 ORFが4 kb以上と長大であったためか、長期間安定して発現する細胞を得るのは困難であった。これを解決するため、レンチウイルスベクターによるdCas9の導入を行なった結果、長期間のdCas9の安定発現を達成することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和二年度はまず、申請書に初年度に計画した検出頻度の評価と、解像度の評価を行う。検出頻度の評価については、ゲノム全体に遍在するヒストンH3に対する抗体と抗Cas9抗体を用いてPLA法を行う。重ねてdCas9の免疫染色を行い、dCas9発現細胞中でのPLAシグナル陽性細胞の割合を算出して検出頻度を評価する。解像度については、解析対象のクロマチンとgRNA設計部位との距離について評価を行う。解析対象のクロマチンについては、令和元年度に解析した活性化エンハンサー部位を対象にする。申請時の計画では、転写因子IRF8の結合部位を解析対象にしていたが、クロマチンの性質上、活性化エンハンサーの方が安定して解析が可能と考えた。この解析ではアセチル化ヒストンH3K27に対する抗体と抗Cas9抗体を用いてPLA法を行い、得られた結果からクロマチンが検出可能なDNA上の距離（塩基数）を算出して解像度を評価する。
さらに、当初から令和二年度の計画の通り、dCas9非発現細胞を用いて、リコンビナントdCas9とgRNAを細胞外から導入する方法を樹立する。この導入方法の樹立は、組織切片での解析を可能にするために必須である。まずは実験条件の最適化のため、固定や膜透過処理が容易な細胞株を使用する。リコンビナントdCas9は予めgRNAと複合体を形成させておく。次に細胞に一次固定と膜透過処理を施し、dCas9-gRNA複合体を添加する。さらに二次固定を行い、PLA法によりクロマチンの検出を行う。この計画で研究を進める予定である。
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| Causes of Carryover |
令和元年度においては、当初の計画を変更して主にバイオインフォマティクスを用いたエピゲノム解析を行った。このエピゲノム解析に使用したデータは、本研究室で過去に取得されたデータ、公開データベースに登録されているデータなどを用いた。前者に関しては、本研究代表者が元来の研究に関わっており、またデータ自体も論文投稿中で発表予定となっている。このエピゲノム解析に使用した解析サーバーなどの機器も、既に研究室に備わっているので、エピゲノム解析に使用する設備品費、消耗品費などが発生しなかった。また、細胞実験で用いたプラスミドなども研究室に既に存在したものを使用した。上記の状況によって、次年度使用額が生じた。
令和二年度はまず、申請書に初年度の計画の中で実施していない部分から順次実行していく予定である。このため、次年度使用額についても初年度に計画した通りに順次に使用する予定である。令和二年度に予定されていた実験については、初年度の実験結果が重要であるので、初年度の実験が終わり次第開始する予定である。令和二年度も計画遂行に遅延が生じる可能性があるが、エフォートを調整することで遅延が生じない様に努力する。
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Research Products
(2 results)
