2019 Fiscal Year Research-status Report
顕微鏡的多発血管炎の新規血清ペプチドバイオマーカー候補AC13の定量系の確立
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19K07392
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| Research Institution | St. Marianna University School of Medicine |
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Principal Investigator |
佐藤 政秋 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 助教 (90463801)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | バイオマーカー / 顕微鏡的多発血管炎 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
顕微鏡的多発血管炎(MPA)の血清で特異的に増加する、アポリポ蛋白A-I(ApoA-I)のC末端13アミノ酸残基からなるペプチド(AC13)の質量分析及びELISAによる定量系を構築し、MPAを近縁疾患から鑑別するバイオマーカーとして確立することを目的とする。
【質量分析】AC13及び内部標準として安定同位体標識AC13を合成した。AC13及び安定同位体標識AC13を健常血清に各々終濃度0－20μM及び20μMで添加した。血清からC18磁気ビーズで抽出したペプチドをMALDI-TOF/MSで測定したところ、1.25－20μM AC13の範囲でAC13濃度とAC13イオン強度/安定同位体標識AC13イオン強度比の間に高い相関を認めた(R2=0.9989)。予備的検討において、MPAの血清AC13濃度(6.3±4.1μM, n=12)は、関節リウマチ(2.0±0.7μM, n=12)、多発血管炎性肉芽腫症(2.3±0.9μM, n=5)及び健常(1.9±0.9μM, n=12)に比し有意に高値を示した(p<0.05)。またMPAの血清AC13濃度とCRPの間に中程度の相関を認めた(r=0.594, p<0.05)。以上の様に、質量分析による血清AC13濃度の測定系の基盤を構築した。
【ELISA】AC13-KLHの免疫により腹水抗体価が上昇したマウスが得られ、その脾細胞よりハイブリドーマを作製した。AC13のN末端は、ApoA-Iには存在しないAC13特異的なエピトープとなる。AC13-BSAを抗原とするELISAでのスクリーニングにより、このAC13のN末端を認識する抗体を産生するミックスクローンを確認した。現在、当該ミックスクローンの限界希釈を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
【質量分析による血清AC13濃度の測定系の確立について】
本年度は、安定同位体標識AC13を内部標準に用いたMALDI-TOF/MSによる定量系を構築する計画であり、実際に当該測定系の基本的な方法を構築した。この測定系により、安定同位体標識AC13のイオン強度に対する血清AC13のイオン強度の比から、血清AC13濃度を算出することが可能となった。さらに、本測定系を用いた患者血清のAC13濃度測定の予備的検討まで到達している。この結果、MPA血清に特異的なAC13の増加(Arthritis Rheum 2011; 63:3613)が再確認された。よって、本項目については予定よりも進行している。
【ELISA定量による血清AC13濃度の測定系の確立について】
本年度は、AC13をマウスに免疫して得られた抗体について、二段階スクリーニングを行い、ApoA-Iを認識しないAC13特異的モノクローナル抗体を得る計画であった。得られた抗体を用いた競合ELISAの系を構築し、患者血清のAC13濃度の予備的定量まで行う予定であったが、到達状況は、当該抗体を産生するハイブリドーマのミックスクローンの確認までである。しかし、現段階のミックスクローンはほぼ単一細胞に近い状態であり、当初困難と考えられていたApoA-Iに結合せずAC13に結合する抗体の獲得が達成できた。また、抗体のスクリーニングのための基本的なELISAの系は確立している。よって、本項目は予定よりはやや遅れているが、内容としては十分に進行している。
以上より、本研究は全体としておおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
【質量分析による血清AC13濃度の測定】
AC13をMPAのバイオマーカーとして確立するために、MPA血清、対照として多発血管炎性肉芽腫症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、その他の血管炎、血管炎以外の膠原病、感染症、健常血清を収集する。血清収集と並行し、現在の質量分析系の改善を行う。C18磁気ビーズを用いて血清からペプチドを抽出する際、血清アルブミン等の血清タンパク質も同時に抽出されてきており、それらが質量分析におけるAC13の検出感度を低下させている可能性がある。マトリックス溶液組成の変更、C18抽出液とマトリックス溶液の混合比率の調整、血清アルブミン除去後にC18磁気ビーズ抽出する等の改善を行うことで、AC13のイオン化効率の向上を図る。測定系の改善後、収集した各疾患の血清AC13濃度を測定し、日間差などの再現性の評価も行う。
【ELISA定量による血清AC13濃度の測定】
AC13のN末端を認識する抗体を産生するハイブリドーマをクローニングする。クローニング後、培養上清より得られた当該抗体を用い、競合阻害の程度で定量する競合ELISAの系を構築し、収集した血清中のAC13濃度を定量する。質量分析とELISAで得られた結果より、定量性や簡便性などについて、質量分析による測定系と比較検討する。
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| Causes of Carryover |
ELISA定量による血清AC13の測定系について、現在、競合ELISA法の測定系に用いる抗体を産生するハイブリドーマのクローニングの段階であり、測定系の構築まで至っていない。そのため、測定系構築にかかる費用が予定よりも少なくなった。また、血清収集は初期段階であり、当初の予定よりも収集費用が発生しなかった。これらの事柄が、次年度使用額が生じた主な理由である。2020年度には競合ELISA測定系の構築および血清収集が本格化するため、生じた次年度使用額はこれらの費用に充てる。
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[Journal Article] Layilin enhances the invasive ability of malignant glioma cells via SNAI1 signaling2019
Author(s)
1.Kaji, T., Arito, M., Tsutiya, A., Sase, T., Onodera, H., Sato, T., Omoteyama, K., Sato, M., Suematsu, N., Kurokawa, M.S., Tanaka, Y., Kato, T.
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Journal Title
Brain Research
Volume: 1719
Pages: 140-147
DOI
Peer Reviewed
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