2019 Fiscal Year Research-status Report
Pathogenesis of senile osteoporosis: regulation of RANKL expression in aging model
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19K07435
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
北澤 理子 愛媛大学, 医学部附属病院, 准教授 (00273780)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
原口 竜摩 愛媛大学, 医学系研究科, 准教授 (00423690)
木谷 彰岐 愛媛大学, 医学部附属病院, 講師 (60380234)
福島 万奈 愛媛大学, 医学部附属病院, 講師 (70546225) [Withdrawn]
小原 幸弘 愛媛大学, 医学系研究科, 助教 (50792214)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 破骨細胞 / RANK / RANKL / 遺伝子プロモータ / メチル化 / 加齢 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
閉経関連骨減少は骨粗鬆症の主因であるが、男女を問わず「老人性骨粗鬆症」の病態解明は、今後の超高齢化社会の重要課題である。骨吸収の主幹となる破骨細胞分化因子RANKLのGFP可視化マウスを樹立して、加齢や糖尿病状態での骨芽細胞や骨細胞におけるRANKLの組織発現を検討する研究計画である。
本研究計画において破骨細胞分化因子RANKLについての研究の根幹となる、RANKL遺伝子転写調節領域の特定部位に1塩基変異を導入した遺伝子改変動物Tnfsf11-GFPマウスの、系統確立と飼育は順調に進行している。本年度は改変動物に導入した変異についての分子的機能評価を行った。RANKLの遺伝子プロモータ領域の当該塩基変異によるプロモータ活性と、EMSAアッセイによるTATA-boxとMeCP2結合配列の機能解析を行った。
破骨細胞株RAW264 の継代数依存的な受容体RANK発現低下と、転写開始部位周辺のCpGメチル化を明らかにした。培養細胞集団でのメチル化陽性細胞の比率や分布を評価するために、細胞培養のcell block標本を用いて、細胞レベルでRANKメチル化陽性を可視化するための基礎検討を行った。個体レベルでは、12ヶ月齢と10.5週齢のマウス脾臓の比較検討では、加齢個体においてRANK遺伝子のCpGメチル化が有意に高く、脾臓細胞ex vivo培養での破骨細胞形成の低下を認めた。これらの研究成果は、第108回日本病理学会総会、日本骨代謝学会総会2019にて報告した。
また、受容体RANK遺伝子発現制御に関わる転写因子ネットワークの解析の一端としてProtein kinase C によるRANK 遺伝子発現と破骨細胞分化促進作用に関する成果を、Biochem Biophys Res Commun. 2019. 515(2):268-274として論文報告した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
遺伝子改変動物Tnfsf11-GFPマウスの確立と飼育は順調に進行し、一定週令の個体数を増やして、骨量測定と全身組織のサンプリングを行った。RANKL遺伝子プロモータ領域の特定部位に入れた塩基変異自体はRANKLプロモータ活性を変化させなかった。TATA-box結合蛋白やMeCP2との結合比率の差がRANKL転写を変化させることを立証する基礎検討を進めている。
破骨細胞分化因子受容体RANKの発現に対して、破骨細胞株RAW264時間負荷によるメチル化集積による発現低下についての検討を行った。培養細胞レベルでのin vitroの時間負荷とメチル化の集積を、細胞培養のcell block標本の最適化、RANK特定部位のメチル化を検出する実験系の基礎検討を行った。
受容体RANK遺伝子発現制御に関わる転写因子ネットワークの解析については、Protein kinase C経路の促進効果を明らかにした。転写因子NFATc1の関与について、阻害剤を用いた検討や、PU.1やMITFとの相乗効果について、検討した。
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| Strategy for Future Research Activity |
RANKL遺伝子プロモータ領域の特定部位に入れた塩基変異のin vitroでの機能評価を行うとともに、遺伝子改変動物Tnfsf11-GFPマウスの個体レベルでの表現型の解析を行う。前年度のサンプリング結果に基づいて、通常のRANKL発現量ではGFP螢光による可視化よりも、抗GFP抗体での免疫染色による評価が有効であり、全身諸臓器での分布を解析する。個体数をさらに増やして、若齢マウスと高齢マウス個体の骨量測定を行い、骨形態計測による骨組織の解析を行う。
受容体RANKの遺伝子発現制御に関して、引き続き、培養細胞レベルの検討と、転写因子ネットワークの解析として、NFATc1を介するpositive feed back機序について検討する。
培養細胞レベルの検討は、「骨細胞ではRANKL遺伝子のpin-point制御が機能するかどうか」について、平成31年度より準備をすすめた骨細胞培養細胞への時間負荷(高継代数)によるRANKL遺伝子発現と遺伝子プロモータのメチル化を重点的に行い、脱メチル化剤による回復実験、酸化的ストレスによる8OH-dG付加はpin-point抑制を解除できるかどうかを解析する。
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| Causes of Carryover |
物品費として、細胞培養実験や細胞組織学的研究の試薬などの購入に支出を行った。細胞培養に適したロットの血清などは、実験室で従来より継続的に使用して、培養細胞の安定性が担保されたものを引き続き使用した。今年度は新規購入の必要がなく、次年度使用額が生じることとなった。
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