2019 Fiscal Year Research-status Report

EBウイルス感染細胞でのCD30による遺伝子異常の腫瘍化への関与とマーカーの解明

Research Project

Project/Area Number	19K07442
Research Institution	Kitasato University
Principal Investigator	渡邉真理子北里大学, 医療衛生学部, 助教 (90270701)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	堀江良一北里大学, 医療衛生学部, 教授 (80229228)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	Epstein-Barr ウイルス / CD30 / リンパ芽球様細胞株 / ゲノム異常 / リンパ増殖性疾患
Outline of Annual Research Achievements	今年度は、Epstein-Barr(EB)ウイルス感染により正常末梢血リンパ球をリンパ芽球様細胞株（LCL）にトランスフォームさせ、LCLに発現誘導したCD30をCD30Lで持続的に刺激、LCL細胞を回収後DNAを抽出してアレイcomparative genomic hybridization（CGH）法、エキソームシークエンスを行うことを目標とした。はじめに、EBウイルス感染により正常末梢血リンパ球（一般に研究用に市販されているものを業者から購入）をリンパ芽球様細胞株（LCL）にトランスフォームさせた。正常末梢血（N=3）から分離した単核球を用いて、抗体ビーズによりB細胞を単離、EBウイルス産生細胞株 B95.8の培養上清を用いてB細胞にEBウイルスを感染させ、シクロスポリンによる免疫抑制下でLCLを樹立した。樹立したLCLでのCD30の発現をフローサイトメトリーで確認し、CD30高発現の細胞をソーティングにより分離して回収した。 LCLの膜上に発現しているCD30をCHO細胞に恒常的に発現させたリガンドCD30Lで持続的に刺激する系は、我々が独自で確立している。この系を用い、樹立したLCL（N=2）を各々CD30Lの刺激の有無で２群に分けて、１ヵ月間培養して回収した。1ヵ月の時点で刺激を入れないコントロールと比較して、CD30シグナルを継続的に入れたLCLを一部回収してスライドクラス上にサイトスピンを行い、ギムザ染色を行った。CD30Lで刺激したLCLはコントロールと比較して細胞の大小不同や核の多核化、大型化が起こっていた。 LCL（N=2、CD30L刺激ありなしの2検体）を回収、DNAを抽出してアレイCGH法により染色体の過剰、欠失、増幅などのコピー数異常、エキソームシークエンスでエクソンの変異を網羅的に解析する準備を行った。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 当初の予定では、今年度中にLCLに発現誘導したCD30をCD30Lで持続的に刺激し、LCL細胞回収後、DNAを抽出してアレイCGH法、エキソームシークエンスを行うことを目標としたが、購入したアジレントのSurePrint G3 Human, CGHマイクロアレイ（400K X 2）６キット全てに品質上の問題があることが年明けに判明した。交換には２ヶ月ほどの時間を要し、交換済みの新たなCGHアレイを用いたハイブリダイゼーションと解析は次年度に行うこととなってしまった。
Strategy for Future Research Activity	まず、前年度予定していたLCLに発現誘導したCD30をCD30Lで持続的に刺激し、そのLCL細胞のDNAを抽出して保存してある。まず、遅れているアレイCGH法を行う。アレイCGH法は当初、業者に委託する予定であったが、学内にて施行が可能となったため方針を変更した。一方、エキソームシークエンスの施行と解析については、アレイCGH法の結果を踏まえ業者に委託する予定である。樹立したLCL（N=2）を各々CD30Lの刺激の有無で２群に分けて、DNA回収と同様にして１ヵ月間培養して回収した。これよりRNAを抽出して、mRNAの発現解析であるRNAシークエンスを業者に委託して行う。これにより遺伝子異常と遺伝子発現の双方の視点からLCLに起きる変化をコンピューター解析する。
Causes of Carryover	アレイCGH法は当初、業者に委託する予定であったが、学内にて施行が可能となったため方針を変更した。そのため見込みより安価で済んだ。生じてしまった余剰金は、エキソームシークエンス解析にあてる予定である。