2019 Fiscal Year Research-status Report
Exhaustively analysis of NETs and METs related diseases in paraffin sections
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19K07448
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| Research Institution | Fujita Health University |
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Principal Investigator |
塩竈 和也 藤田医科大学, 医療科学部, 講師 (10387699)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
塚本 徹哉 藤田医科大学, 医学部, 教授 (00236861)
尾之内 高慶 藤田医科大学, 共同利用研究設備サポートセンター, 講師 (20632954)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 好中球細胞外トラップ / マクロファージ細胞外トラップ / 免疫染色 / ホルマリン固定パラフィン切片 / 結核症 / 大腸癌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
われわれは、好中球細胞外トラップ（Neutrophil Extracellular Traps: NETs）の組織化学的解析に着目して研究を進めてきた。本年度は、これまでの技術を活かしてホルマリン固定パラフィン切片におけるマクロファージ細胞外トラップ（Macrophage Extracellular Traps: METs）の免疫組織化学的検出法の確立を行った。臨床検体の使用に際して、「医学研究倫理審査委員会」へ研究申請書を提出して評価者の客観的な審査を受けた。本学大学病院に保管されているホルマリン固定パラフィンブロックのうち、慢性炎症疾患（結核症、悪性腫瘍）を対象として検討した。マクロファージの証明としては、CD11c/Integrin alpha X、CD14、CD68、CD80、CD163、CD204を用いた。核成分の証明としては、NETsと同様にクロマチン脱凝集タンパクであるシトルリン化histone H3（cit-H3）を用いた。詳細な条件検討の結果、CD68、CD163、CD204が良好な染色性を示した。M1型マクロファージを検出するCD11cとCD80は、いずれも良好な染色像を得ることが困難だった。M1型とM2型マクロファージを認識するCD68、M2型マクロファージを認識するCD16あるいはCD204を組み合わせた二重染色系を確立することで、M1型とM2型マクロファージを鑑別することができた。結核症では、乾酪壊死にNETsの残骸が確認され、乾酪壊死と肉芽腫の境界部にはMETsではなく紡錘状のマクロファージ（類上皮細胞）のみが確認された。大腸癌では、METsは認められなかったものの、がん腺腔内の壊死部にNETsが確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在までに得られた結果は以下の９点である。①ホルマリン固定パラフィン切片におけるMETsの証明として、CD68、CD163、CD204が良好なマーカーだった。②M1型マクロファージを証明するCD11cとCD80の検出系を確立するまでには至らなかった。③M1型とM2型マクロファージを認識するCD68、M2型マクロファージを認識するCD163あるいはCD204の二重染色を行うことで、M1型とM2型マクロファージを鑑別する方法を採用した。④結核症について、好中球やマクロファージが浸潤した肺胞内部では、cit-H3、NETsマーカーであるmyeloperoxidase（MPO）、neutrophil elastase（NE）およびlactoferrin（LF）が線維状に陽性を示し、NETsの存在が確認された。⑤結核菌の検出として、BCGを用いた免疫染色を行った。BCGが線維状に検出された部分と一致して、cit-H3が線維状に陽性を示し、NETsに捕らえられた結核菌の検出に成功した。⑥乾酪壊死はNETsマーカーが陽性を示し、METsの存在は確認できなかった。⑦大腸癌では、がん腺腔内の壊死部にNETsが確認され、METsの存在は確認できなかった。⑧壊死部のNETsは、HE染色所見により１）好塩基性の線維状NETs、２）線維状が不明瞭なNETs、３）好酸性壊死内のNETsに分類された。⑨ ⑧のいずれにおいてもNETsマーカーが陽性を示し、光－電子相関顕微鏡（Correlative light and electron microscopy: CLEM）法によって、線維状の核成分にMPOの顆粒状シグナルが確認された。
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| Strategy for Future Research Activity |
ホルマリン固定パラフィン切片におけるNETsとMETsの免疫組織化学的検出の確立に成功した。これによって、本学大学病院に保管されている諸種疾患のパラフィンブロックを対象とした免疫組織化学的解析を後押しすることができる。がんの微小環境にフォーカスして、NETsとMETsの関与と意義についてさらなる免疫組織化学的解析を行う。NETsにトラップされたがん細胞は、殺されることなく微小血管に接着して血管外へ浸潤する報告があるため、NETsががんの転移に関与しているのかについてもあわせて解析する。多重染色の改良として、Opal染色キットを用いた検出系の確立を行う。Opal染色キットは、今まで問題となっていた抗体の動物種、一次抗体と二次抗体の組み合わせなどを検討する必要がない簡便な染色ツールである。検出系にはチラミドシグナル増感を採用しており、微量なシグナルの検出にも対応している。さらに、膠芽腫におけるNETsとMETsの関与についても同時平行して解析を進める。
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| Causes of Carryover |
本年度は足がかりとしての研究だったため、予想以上に費用を消化しなかった。次年度以降は、免疫組織化学的検出以外にも電顕観察など費用がかさむことが予想される。本費用はおもに消耗品にあてて研究を充実させる。
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Research Products
(2 results)
