Cell cycle regulation of triple-negative breast cancer by newly-identified nuclear protein network.

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07449
• Research Institution: Aichi Medical University
• Principal Investigator: 笠井 謙次 愛知医科大学, 医学部, 教授 (70242857)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 乳癌 / トリプルネガティブ乳癌 / FAM64A / DNA修復機構

Outline of Annual Research Achievements

本研究では約47%のトリプルネガティブ乳癌（TNBC）に発現している核蛋白FAM64Aとその結合蛋白から見た、TNBCの細胞増殖特性と新規治療戦略のための基盤的知見を得ることを目的としている。
免疫組織学的解析に関して、前年度までの成果を受け臨床情報の統計解析と共に、各種細胞周期マーカーやTP53発現との関係性を追加検討を行った。これまでにFAM64A陽性TNBCは陰性TNBCよりもKi67 indexが高い傾向にあるが有意とは言い難いことを見出しているが、cyclinAやGemininなどのより周期特異性の高い細胞周期マーカーの免疫染色及び培養細胞での実験結果を踏まえると、FAM64A陽性TNBCでは細胞周期の各段階の長さが変化している可能性が疑われた。つまりFAM64A陽性TNBCは、陰性TNBCとは質的差異のある別カテゴリー疾患ではなく、むしろ細胞周期の進行状態の変化した疾患群であろうとの推測を立てている。
細胞周期を一致させていない状態の培養細胞を持ちたimmunoblot解析では、確かにFAM64A蛋白発現の多い細胞株と少ない細胞株が存在するが、後者を蛍光染色にて観察すると、FAM64A陽性細胞の混在を認める。double thymidine block法により細胞周期を一致させてのimmunoblot解析を試みたが、細胞株によりTP53変異の有無などチェックポイント阻害の状態が異なることもあり、周期の一致が十分ではなく、明解な結果を得られなかった。今後はFucciなど他の細胞周期インジケーターを併用して、FAM64A高発現の意義を解析する予定である。
また核内結合蛋白に対するPLA法では、恐らく核内マトリックスの複雑性の為、十分な結果が得られなかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

乳癌免疫染色結果から細胞周期を再評価する必要が示唆されたが、培養細胞でのimmunoblot解析では、double thymidine block法では細胞株ごとに周期の一致度が異なり、明解な解析結果が得られなかった。そのため、Fucciなど別の細胞周期インジケーターを用いた解析が必要になったため。
また遺伝子導入により強制発現させたFAM64A蛋白と共沈した核内蛋白から質量分析(MS/MS)を行って、FAM64A結合蛋白候補について絞り込みを行っているが、これら候補蛋白が真に細胞内でFAM64Aと意義ある結合をしているかの検証するため、PLA法を試みた。
細胞質内の別蛋白に対する予備実験では正しいPLA結果が得られたが、FAM64Aと結合候補蛋白とのPLA法では明解な結果が得られなかった。これはこれら核内蛋白が複雑な核内マトリックスに組み込まれている、あるいは巨大な蛋白複合体の中に組み込まれているため、抗体のアクセスが十分ではなくPLA反応が得られなかった為と考えている。

Strategy for Future Research Activity

細胞周期の検証に関し、Fucciベクターの供与を受けてFAM64A蛋白発現と各細胞周期の関係を解析する。
またFAM64A結合蛋白候補の検証のため、抗tag抗体ではなく、FAM64A抗体での免疫沈降と質量分析を行って、artificialな結合でないことを検証する。

Causes of Carryover

核内結合蛋白に対するPLA法解析では条件設定段階で明解な結果が得られず、本格的な解析に進められなかったため、使用した抗体試薬や細胞培養用試薬、プラスチック製品が少なかったため。