2019 Fiscal Year Research-status Report
A new approach to the pathogenesis of pancreatic cancer and the disorders of circadian rhythm based on the analysis of CRY1-binding proteins
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19K07498
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| Research Institution | Yamagata University |
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Principal Investigator |
岡野 聡 山形大学, 医学部, 助教 (60300860)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 賢一 東北医科薬科大学, 医学部, 教授 (10282055)
中島 修 山形大学, 医学部, 教授 (80312841)
安井 明 東北大学, 加齢医学研究所, 加齢研フェロー (60191110)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | リプログラミング / 膵島内膵管異型細胞 / 前癌病変 / 亜鉛結合不全CRY1 / 生物時計 / 時計遺伝子 / 膵β細胞 / KPNA2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
変異型CRY1タンパク質（亜鉛結合能を欠いたCRY1）の過剰発現マウス[reviewed in Okano S. 2016]（以下Tgマウスと略称）の膵β細胞において,野生型と比較してKPNA2の発現が減少することを明らかにした論文を,今年度初頭に公開した[下記発表論文参照]。新たに今年度,膵β細胞株MIN6細胞を用いて,亜鉛によるCRY1の調節, およびKPNA2の発現調節機構の理解を深めることを目的とした下記の実験を行った。
文献で報告されている手法に従って, MIN6細胞をKClで24時間処理し, MIN6細胞内の亜鉛を枯渇させると共に慢性高血糖を模倣した状態を作り,その細胞への影響を調べた。その結果,亜鉛欠乏はmRNAとタンパク質の両方のレベルでKPNA2を減少させることが判明し,マウスβ細胞での結果を支持する結果を得た。β細胞遺伝子の中では,Glut2の発現が特に影響を受け,その発現は著しく減少した。各種の時計遺伝子の発現に変化が見られ,β細胞の生物時計調節における亜鉛の関与が示唆された。本条件下で,β細胞においてChop遺伝子の発現が誘導されることも示した。
マウスの解析については,Tgマウスで見られる特異な病変であるintra-islet duct（膵島内膵管異型）の特徴づけを目的として種々の染色実験を実施した。その結果,DBA-レクチンの反応性が, 正常膵管と比較し,特に発生初期のintra-islet ductで弱いこと見出した。このことは,膵管細胞としては未成熟な段階にあることを示していると考えており,intra-islet ductの生成過程を明らかにする上での重要な知見を得た。
プロテオミクス解析からCRY1複合体構成タンパク質としてFAM98Aを新たに特定し,このタンパク質が膵管異型細胞で強く発現し,病変の進展に一定の役割を果たす可能性を示す結果も得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ここ４年間,自身の時間的研究資源を重点的に割いて注力してきた,膵管癌前駆病変の研究成果を論文公表した[下記発表論文参照]。当論文にて,亜鉛結合能を欠いたCRY1の過剰発現は,マウス膵β細胞に細胞老化をもたらし,その結果として前癌病変様のintra-islet duct生成を含む膵構造の経時的変化がもたらされる機序を議論した。さらに,慢性高血糖状態が KPNA2の発現量低下に関与する可能性を指摘し,膵β細胞の機能維持におけるKPNA2の重要性を当該発表論文にて議論した。その発展としての,膵β細胞(MIN6細胞)を長期間KCl処理し細胞内亜鉛を減少させる新たな実験から,β細胞におけるKPNA2発現量調節制御の新しい知見を得ることができた。この条件下のMIN6細胞において,一群の時計遺伝子の発現が変化する結果を得たが,この現象には,亜鉛によるCRYを介した作用が変化したことも寄与していると考えられる。β細胞における亜鉛のCRY機能制御の分子機序解明に向けて,一定の成果が得られた。
MIN6細胞の解析の成果,及びマウス組織でのintra-islet ductの解析の成果を,それぞれIDF congress 2019(釜山)及び第79回米国糖尿病学会(サンフランシスコ)の国際学会で発表した（いずれの成果もe-posterとして, 学会期間後も当該学会のweb siteにて公開している）。
CRYのプロテオミクス解析については,加齢研チームが主体になり成果を出した。
研究分担者はもちろんのこと,連携研究者・研究協力者として本cryptochrome(CRY)研究グループに長年参画している各研究者とも,引き続き有意義な学問的議論が行われた。有機的研究ネットワークを活かした,研究推進に資するプラットフォームを強化し連携を深めることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
Tgマウスと野生型マウス各々の膵臓パラフィン切片から,膵島をレーザーマイクロダイセクションにより採取しRNAを精製した。これらのサンプルを用いたDNAマイクロアレイの網羅的遺伝子発現解析を,今年度既に実施し,intra-islet duct生成と関連付けた解析が現在進行中である。
今後,関連のあるタンパク質について抗体を購入して免疫組織学的に解析する。CRY1は,転写因子PDX-1をタンパク質レベルで調節している可能性が得られたため(IDF congress 2019,Okano S. et al. e-poster: P-0359を参照), この解析を生化学的に進める予定である。
研究計画にそって, 上記のMIN6細胞の実験系に加え,膵癌細胞株を用いた実験も行う予定である。
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| Causes of Carryover |
DNAマイクロアレイ解析に関して今年度はin silicoの解析に注力した。この結果を基にして消耗品を購入する必要があり,次年度使用額が生じた。
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