糖鎖構造に着目したタイラーウイルス受容体の探索と脱髄疾患の制御

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07511
• Research Institution: Tohoku Medical and Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 武田 和也 東北医科薬科大学, 医学部, 助教 (40393160)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: タイラーウイルス / 糖脂質 / ガングリオシド

Outline of Annual Research Achievements

タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス（TMEV）感染による中枢神経系の脱髄疾患（TMEV-IDD）は、ヒトの多発性硬化症（MS）モデルの一つとされている。近年、心筋炎や、てんかん発作モデルについても報告されているが、TMEVの感染機序は、その感染受容体（TMEVR）を含めて不明である。
筆者らはTMEVR探索の過程でTMEV結合細胞と非結合細胞においてGM1ガングリオシド（GM1）量が異なることを見いだし、TMEV感染／脱髄発症におけるシアル酸／糖鎖の役割に着目した。本研究計画では遺伝子、タンパク質、糖鎖の解析を通じてTMEVRの同定／感染機序を解明し、これらを標的とした病態制御の可能性について検証することを目的とした。
これまで、マウスの各種細胞を用いて、フローサイトメトリー（FCM）や薄層クロマトグラフィー（TLC）、定量PCR（qPCR）により、TMEV結合細胞でGM1などのシアル酸結合糖鎖が多く存在することを明らかにした。そこでTMEV非結合細胞に対してGM1を添加し、TMEV結合量の変化についてFCMによる解析を試みたが変化は認められず、TMEVが直接、GM1と作用する可能性は低いと考えられた。一方、TMEV結合細胞についてFCMによる解析を進めていく中で、TMEV結合により染色性が低下する抗体があることを見出した。この結果は、その抗原とTMEVとが直接結合していることを示唆するものであることから、この分子とTMEVとの結合について検討を開始した。同実験系において、細胞にTMEVを添加するより前に、この抗体による染色を行うと染色性が回復する結果が得られ、両者が、抗原への結合において競合している可能性がある。この分子はTMEVRの一つである可能性があり、今後の解析によりTMEV感染機序の解明に大きく役立つものと期待される。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

マウス由来のTMEV結合細胞と非結合細胞間のFCMやTLCによる糖脂質の解析、qPCRによる糖脂質合成経路酵素群の発現量の比較解析により、TMEV結合細胞においてシアル酸結合型糖鎖が多く存在することを明らかにした。GM1など数種類のガングリオシドを細胞に添加してTMEV結合量の変化をFCMにより解析し、TMEVと直接作用する可能性のある糖脂質について検討を行った結果、TMEVが直接、GM1等に作用している結果は得られなかった。その一方で、TMEV結合細胞についてFCMによる解析を行なっていた際に、TMEV結合により染色性が低下する抗体を見出した。この抗体が認識する抗原部位とTMEVが結合している可能性が示唆されたことから、この抗原とTMEVが結合しているかどうかについて、さらなる解析を開始した。
以上、予期せず当初の計画（TMEVと結合する分子を単離、解析する）とは異なる方法であるが、本研究課題の大きな目標であるTMEVRの同定について、その候補分子を新たに見出すことが出来た。また、抗体との結合の競合という、当初計画にはなかったTMEVRの探索方法について検討することが出来た。

Strategy for Future Research Activity

これまでの実験結果から、TMEV感染において、細胞表面のGM1に対して直接、TMEVが作用している可能性は低いと考えられた。一方、FCMによる解析において、TMEVと競合する抗体を見出したことから、この抗原についてさらなる解析を加え、TMEVとの結合について明らかにする。この抗原は、TMEV非結合細胞においてもその発現が確認されているが、この細胞ではTMEV添加による抗体染色性の低下は観察されなかった。この結果は、抗原へのTMEVの結合が、抗体との結合を阻害していることを予想させる。同時に、TMEV結合細胞と非結合細胞において抗原の構造に違いがある可能性が考えられ、今後、タンパク質構造に加え、糖鎖などの修飾の違いについて解析していく予定である。
当初計画では「TMEV結合タンパク質の免疫沈降－質量分析法によるTMEVRの探索」を計画していたが、本年度に見出したTMEVと直接結合している可能性が示唆された抗原について、さらに詳細な解析を行っていく。また本研究計画の３つの柱のうちの残り一つである「遺伝子編集／導入によるTMEVRの探索／検証」については、このTMEVR候補分子とTMEVとの結合の解析結果を見ながら、変異導入などによるTMEV結合能、機能の検証を行う計画である。以上の実験を通じて、TMEVRの同定と感染に寄与するタンパク質／糖鎖構造を解明し、TMEV-IDDにおけるそれぞれの役割の解明と、これらを標的とした病態の制御の可能性について検証する。