2020 Fiscal Year Research-status Report

上皮組織バリアによる臓器機能・生体内ネットワークの調節機構の解明

Research Project

Project/Area Number	19K07513
Research Institution	Dokkyo Medical University
Principal Investigator	伊藤雅彦獨協医科大学, 医学部, 准教授 (70270486)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2023-03-31
Keywords	肝臓 / 肝細胞 / 毛細胆管バリア / 胆汁鬱滞 / タイトジャンクション / ZO-1 / ZO-2 / 血管内皮
Outline of Annual Research Achievements	前年度、家族性進行性胆汁鬱滞症type４の責任遺伝子であるZO-2および類似分子のZO-1の両分子を肝臓特異的に欠損するマウス(DKOマウス)を樹立した。DKOマウスは成長障害を伴って６週齢までに全個体が死亡した。本年度、樹立したマウスについてより詳しい解析に取り組んだ。３週齢個体の肝臓組織を病理解析したところ、DKOマウスでは肝小葉構造が不明瞭になり、類洞血管の走行にも異常をきたしていた。個々の肝細胞をみると、細胞内に空胞が存在し、細胞が肥大化する傾向が認められた。さらに電子顕微鏡にて観察すると、DKOマウス肝細胞ではミトコンドリアの膨潤が起きており、これらのことから細胞障害が起きていると考えられた。また、毛細胆管構造についても、細胞膜上での位置や微絨毛の存在に異常が起きており、肝細胞間のTight Junction構造が消失していた。Tight Junction分子の発現を検討したところ、mRNAおよびタンパク質全体量にはあまり大きな変化はなかったが、細胞骨格と結合してTight Junctionバリアに寄与する分画に存在する分子の量が大きく低下していた。さらに、胆汁酸を毛細胆管に放出するトランスポーターAbcb11/Bsepタンパク質が著しく減少していた。そこで、蛍光標識物質を用いた生体ライブイメージングによって、肝臓における血管から毛細胆管への物質移動を解析したところ、DKOマウスでは血管から肝細胞内への物質移動はコントロールマウスと同様に起きているものの、取り込んだ物質の毛細胆管への放出が起きず、代わりに血管側に放出される様子が確認された。これらの結果は、DKOマウスではTight Junctionバリアのみならず細胞極性の形成にも異常をきたし、毛細胆管への物質放出に働くトランスポーターが正常に機能できなくなったがために、胆汁鬱滞を呈していることを示唆している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 昨年度述べたように、当初予想よりも肝臓特異的ZO-1・ZO-2欠損マウスの樹立に時間を要したため、計画全体が若干遅れ気味になっている。また、血管内皮特異的にCreを発現するトランスジェニックマウスをリソースセンターから購入するにあたり、学内の諸手続きに想定以上の時間が掛かったため、発注以降のスケジュール全体が遅れることになったが、さらに大学動物施設内で飼育するためのSPF化に半年近い時間を要したことから、解析計画に遅延が生じている。これらのことから、現在までの進捗状況をやや遅れているとした。
Strategy for Future Research Activity	血管内皮特異的にCreを発現するトランスジェニックマウスとfloxマウスを交配し、ZO-1, ZO-2を血管内皮特異的に欠損するマウスの樹立を行う。樹立できた場合、まずは組織解析を行いたい。また、実績の概要で述べたように、肝臓特異的にZO-1, ZO-2の両分子を欠損させるとヒト胆汁鬱滞症に類似した変化を示したが、ZO-2のみを欠損するマウスの飼育期間を伸ばして解析したところ、肝臓が腫大化し脂肪滴が蓄積するなど、NAFLDに類似した症状を示すことが明らかになった。今後、この加齢によって生じる肝臓特異的ZO-2欠損マウスの異常について、詳しい解析を進める予定である。
Causes of Carryover	【理由】上述のように、マウスの入手やSPF化の遅れなどが生じたため、当初予定していた解析を先送りすることになるなど、計画が全体的に遅延する状況にある。それにより、新たに購入する試薬類が当初の予定よりも減少したことなどが、次年度使用額が生じた主たる理由である。【使用計画】変異マウスの作製と飼育を継続するため、まずこれに要する費用に使用させて頂く予定である。肝臓特異的遺伝子欠損マウスに関しては、胆汁酸や中性脂肪などの生化学的解析を行うための試薬類や、遺伝子解析用の試薬類、細胞生物学的解析用の試薬類の購入のために使用させて頂く。血管内皮特異的遺伝子欠損マウスについても、肝臓用とは別途に遺伝子解析用の試薬類や細胞生物学的解析用の試薬類が必要になるため、それらの購入のために使用させて頂く予定である。進捗状況によっては、網羅的遺伝子解析などを外部委託して行うことを想定しており、そのための経費として使用させて頂きたいと考えている。十分なデータを得ることができれば、学会発表や論文発表のためにも使用したいと考えている。