上皮組織バリアによる臓器機能・生体内ネットワークの調節機構の解明

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07513
• Research Institution: Dokkyo Medical University
• Principal Investigator: 伊藤 雅彦 獨協医科大学, 医学部, 准教授 (70270486)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 肝細胞 / 毛細胆管バリア / 胆汁うっ滞 / 脂肪肝 / タイトジャンクション / ZO-1 / ZO-2

Outline of Annual Research Achievements

近年、上皮バリア構造タイトジャンクションの構成分子の変異が原因となる遺伝性疾患の報告が増加しており、最近新たに家族性進行性胆汁うっ滞症4型PFIC4の責任遺伝子がタイトジャンクション構成分子ZO-2であることが明らかにされた。ZO-2はタンパク質複合体形成能を通じて上皮バリア調節に働くが、肝細胞におけるZO-2の欠損が、どのようにして当該疾患の発症と進行につながるのか明らかにはなっていない。本研究では、マウスモデルを用いてこの問題に取り組むこととした。
ZO-2を全身性に欠損するマウスは胎生10日前後で致死となるため、肝臓における変化を解析することは困難である。そこで、ZO-2 floxedマウスとAlbumin-Creトランスジェニックマウスを交配し、肝臓特異的にZO-2を欠損するマウスを作製した。肝臓特異的ZO-2欠損マウスは軽微な胆汁うっ滞を呈したが、PFIC4患者のような重篤な状態には至らなかった。その理由として、ZO-2に類似した一次構造を持つ分子ZO-1が機能を代替している可能性が考えられた。そこで、ZO-2とZO-1を同時に肝臓特異的に欠損するマウス(DKOマウス)を樹立した。DKOマウスは胆汁うっ滞を呈すると同時に成長障害を示し、６週齢までに全個体が死亡した。また、肝小葉構造が不明瞭になり、毛細胆管構造についても細胞膜上での位置や微絨毛の存在に異常が起きるなど、PFIC4患者肝臓に類似した特徴を示すことが明らかになった。
一方で、肝臓特異的ZO-2欠損マウスの飼育を１年間継続したところ、徐々に肝臓に変化が起きることが明らかになってきた。また、食事内容によってもコントロールマウスと比較して肝臓に異常が起きることを見出した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

肝臓特異的ZO-2欠損マウスは若齢期においては軽微な胆汁うっ滞を呈するのみであったが、８カ月齢ごろより次第に肝臓が肥大化し、１２カ月齢ごろには明らかな肝腫大を起こすようになった。腫大化した加齢マウスの肝臓を摘出して解析した結果、肝細胞内に大きな脂肪滴が蓄積して脂肪肝となっていることが明らかになった。そこで、肝臓特異的ZO-2欠損マウスは脂質代謝に変化をきたしている可能性を考え、高脂肪食、高コレステロール食、高胆汁酸食を付与し、コントロールマウスとの違いについて検討している。現在までに、特定の条件下において肝臓特異的ZO-2欠損マウスはコントロールマウスに比較して肝臓に脂肪が蓄積しやすくなることを見出しているが、若齢期に肝腫大を起こすには至っていない。これらマウスの飼育に時間を要し、また肝腫大状態に至るには約１年間かかるため、現在までの進捗状況をやや遅れているとした。

Strategy for Future Research Activity

オミックス解析を取り入れ、肝臓特異的ZO-2欠損マウスに生じる異常に関わる分子機構を明らかにしていく。肝臓に関しては、遺伝子発現の変動とタンパク質発現の変動が一致しないとの先行研究が多数存在することから、トランスクリプトーム解析およびプロテオーム解析の両方を実施する。
また、マウスの年齢や食事について複数条件でコントロールマウスとノックアウトマウスを比較する。年齢については、若齢期の2～４ヵ月、肝臓の腫大化が起きる前段階の6～８ヵ月、腫大化が起きた1２ヵ月の３段階について解析を行う。食事については、通常食、高コレステロール食、高胆汁酸食および高コレステロール高胆汁酸食の４種類の場合について比較する。得られるデータをIPAなど経路解析によって検討し、ZO-2欠損を端緒として肝臓に生じる変化の分子機序について明らかにしていく。

Causes of Carryover

【理由】マウスの加齢変化に着目した解析に取り組んでおり、解析までに最長１年余の飼育を要するなど長期間かかるために、いくつかの実験については実施に至る前段階にある。それにより、新たに購入する試薬類が当初の予定よりも減少したことなどが、次年度使用額が生じた主たる理由である。
【使用計画】上述のように、コントロールマウスとノックアウトマウスについて、３段階の飼育期間および４種類の食事条件で比較解析するため、マウスの交配と飼育を継続する必要がある。そのための動物飼育費用に使用させて頂く予定である。トランスクリプトーム解析およびプロテオーム解析は大学施設を利用して実施することが困難であるため、外部受託業者に依頼する予定である。どちらの解析も一般的に高額であるため、次年度使用に回した研究費を活用して行いたい。その他、生化学的解析を行うための試薬類や、遺伝子解析用の試薬類、細胞生物学的解析用の試薬類の購入のために使用させて頂きたい。十分なデータを得ることができれば、学会発表や論文発表のためにも使用したいと考えている。