2022 Fiscal Year Research-status Report
上皮組織バリアによる臓器機能・生体内ネットワークの調節機構の解明
| Project/Area Number |
19K07513
|
|---|
| Research Institution | Dokkyo Medical University |
|---|
Principal Investigator |
伊藤 雅彦 獨協医科大学, 医学部, 准教授 (70270486)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2024-03-31
|
| Keywords | 肝細胞 / 毛細胆管バリア / 胆汁うっ滞 / 脂肪肝 / タイトジャンクション / ZO-1 / ZO-2 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
ヒト遺伝性疾患において、上皮バリア構造タイトジャンクションの構成分子の変異が原因となる事例の報告が増加している。最近新たに、家族性進行性胆汁うっ滞症4型PFIC4の責任遺伝子がタイトジャンクション構成分子ZO-2であることが明らかにされた。ZO-2はタンパク質複合体形成能を通じて上皮バリア調節に働くが、肝細胞におけるZO-2の欠損が、どのようにして当該疾患の発症と進行につながるのか明らかにはなっていない。この点を解明するため、肝臓特異的にZO-2を欠損するマウスを作製した。
肝臓特異的ZO-2欠損マウスは軽微な胆汁うっ滞を呈したが、PFIC4患者のような重篤な状態には至らなかった。そこで、ZO-2に類似した一次構造を持つ分子ZO-1が機能を代替している可能性を考慮し、ZO-2とZO-1を同時に肝臓特異的に欠損するマウス(L-ZO1/2-DKOマウス)を樹立した。L-ZO1/2-DKOマウスは胆汁うっ滞を呈すると同時に成長障害を示し、６週齢までに全個体が死亡した。また、肝小葉構造が不明瞭になり、毛細胆管構造についても細胞膜上での位置や微絨毛の存在に異常が起きるなど、PFIC4患者肝臓に類似した特徴を示すことが明らかになった。
その一方で、ZO-2のみを肝臓特異的に欠損させたマウスは、８カ月齢ごろより次第に肝臓が肥大化し、１２カ月齢ごろには明らかな肝腫大を起こすようになった。したがって、ヒトと時間経過は異なるものの、マウスにおいてもZO-2欠損は肝臓の構造と機能に障害を及ぼすことが明らかになった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
L-ZO1/2-DKOマウスの肝臓を詳しく解析したところ、肝細胞索構造と類洞の配列が乱れていた。また、zonationが変化し、E-cadherin陽性のzone1が拡張する一方で、zone3を特徴づけるグルタミン合成酵素陽性細胞が減少していた。L- ZO1/2-DKOマウス肝細胞内では、vacuoleの出現およびミトコンドリアの膨潤といった異常が認められた。また、本来はapicalに存在する毛細胆管の位置が不規則となり、形態にも異常が認められた。分子レベルの解析を行なったところ、タイトジャンクション構成分子の局在異常のみならず、毛細胆管への物質排出に関わるトランスポーターがapical膜へ局在化できないという変化が起きていた。
一方、加齢によって腫大化した肝臓特異的ZO-2欠損マウス肝臓を組織解析した結果、肝細胞内に大きな脂肪滴が蓄積して脂肪肝となっていることが明らかになった。そこで、脂質代謝に変化をきたしている可能性を考え、高脂肪食、高コレステロール食、高胆汁酸食を摂取させ、コントロールマウスとKOマウスで違いの有無を検討した。その結果、高胆汁酸食を摂取させた場合、コントロールマウスと比較してKOマウスの肝臓に脂肪が蓄積しやすくなっていた。この表現系について再現性を確認するなどの解析に時間を要しているため、現在までの進捗状況をやや遅れているとした。
|
| Strategy for Future Research Activity |
L-ZO1/2-DKOマウスはPFIC4の病態に類似した表現系を示すことから、L-ZO1/2-DKOマウス肝において生じている分子変化を詳細に解明することによって、PFIC4の発症・進行機構について理解を深めることができると考えている。そのために、肝臓における変化が現れる比較的初期段階にあたる２週齢、症状が進んだ状態の４週齢のマウス肝臓から、RNAおよびタンパク質を抽出し、トランスクリプトーム解析およびプロテオーム解析を実施する。
これにより、タイトジャンクション構成分子の変異が具体的にどのような分子経路にどのような影響を及ぼし、PFIC4のような胆汁うっ滞を引き起こすのか明らかにすると同時に、治療に役立つような知見の獲得を目指す。
また、ZO-2のみを肝臓特異的に欠損させたマウスについて、年齢や食事について複数条件でトランスクリプトーム解析およびプロテオーム解析を実施する。具体的には、若齢期の2～４ヵ月、肝臓の腫大化が起きる前段階の6～８ヵ月、腫大化が起きた1２ヵ月の３段階について解析を行う。食事については、通常食、高コレステロール食、高胆汁酸食および高コレステロール高胆汁酸食の４種類の場合について比較する。得られるデータをIPAなど経路解析によって検討し、ZO-2欠損を端緒として肝臓に生じる変化の分子機序について明らかにしていく。
|
| Causes of Carryover |
【理由】時系列を追った解析および様々な飼育条件に応じた解析を実施するため、多数のマウスが必要となるが、動物実験施設の状況によってマウスの用意が遅れている。そのために、受託解析を予定しているトランスクリプトーム解析およびプロテオーム解析の実施にも遅れをきたしたため、次年度使用額が生じた。
【使用計画】今後の研究の推進方策に記した解析を実施するために使用していく。具体的には、週齢や食事条件で比較解析するためのマウスの交配と飼育を継続するための動物飼育費用、トランスクリプトーム解析およびプロテオーム解析は大学施設を利用して実施することが困難であるため、外部受託業者に依頼するための費用に充てる予定である。どちらの解析も一般的に高額であるため、次年度使用に回した研究費を活用して行いたい。その他、生化学的解析を行うための試薬類や、遺伝子解析用の試薬類、細胞生物学的解析用の試薬類の購入のために使用させて頂きたい。十分なデータを得ることができれば、学会発表や論文発表のためにも使用したいと考えている。
|
Research Products
(2 results)
