2020 Fiscal Year Research-status Report
Imaging the ATP metabolism in Trypanosoma cruzi intracellular amastigotes
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19K07523
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
稲岡 健ダニエル 長崎大学, 熱帯医学研究所, 准教授 (10623803)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | トリパノソーマ原虫 / エネルギー代謝 / Ateam / ATPバイオセンサー / ミトコンドリア / グリコソーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Trypanosoma cruziはシャーガス病を引起す寄生原虫で、その生活環において、媒介昆虫内（EPI）、血流中（TRP）、細胞内（AMA）の3つのステージに大きく分けられる。臨床的に重要なのはAMAであるが、大量培養系が確立されておらず解析が困難である事から、特に研究が進んでおらず、AMAで用いられる炭素源やエネルギー代謝における各細胞小器官の役割など、基礎的な情報すら未だ不明である。本研究の最終目的は、寄生現象を支えるエネルギー代謝の生理的役割を解明することである。
2020年度では、ATPのバイオセンサーとして開発されたATeamをミトコンドリア、グリコソーム、細胞質それぞれに発現させた各種組換原虫の解析を進めた。グリコソーム局在ATeam原虫では、グリコソームに局在を示唆するシグナルが得られたが、強度が不十分であった。細胞質に局在するATeam原虫では、ATeamが凝集してしまい、細胞質への局在が確認できなかった。また、ミトコンドリアに局在させたATeam原虫では、ATeam自体の発現が確認されなかった。また、空ベクターを形質転換させた原虫と比較して、各種組換え原虫の増殖が遅くなった。一方、大腸菌で発現させた組換えATeamに関しては、細胞質型とグリコソーム型のATeamの精製を行い、ATP結合によるFRETシグナルに変化がないことが確認できた。今回、T. cruzi原虫でATeamの発現自体が毒性を示す事が明らかとなり、そのため、FRETとは異なる原理を持つMaLionR/Gといった、ほかのATPバイオセンサーを用いて組換え原虫を作成し、解析を試みる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
昨年度は、ATeamの発現を安定する条件や、原虫に対するAteam自体の毒性を減らすために発現用プラスミドの変更や、セレクション条件を検討したが、Ateam発現原虫の改善が見られなかった。そのため、ATeamではなくMaLionR/Gを用いたATPセンサーを発現する原虫の構築を最初から開始したため、当初の予定よりは「やや遅れている」と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
ATeamを安定に発現させた原虫の構築が毒性により得られなかったため、今後はFRETとは異なる原理をもつMaLionR/Gを用いて研究をすすめる。
MaLionは「Monitoring ATP Level Intensity-based turn-on indicators」と呼ばれ、ATPが結合することにより赤色（MaLionR）または緑色（MaLionG）の蛍光を示す。ATeamと比較し、分子量が小さいうえに、シグナルの変化が高いため、感度も上がる。また、ATP加水分解活性は持っておらず、ATPが結合することによって蛍光を発するturn-onセンサーである。これまでには、ヒト細胞及び植物細胞でMaLionR/Gを用いたATP動態の研究が報告されており、原虫の解析に用いるのは本研究が初めての試みである。T. cruziを用いてMaLionR/Gの発現と解析方法はこれまでと同じように、グリコソーム・細胞質・ミトコンドリアの各細胞区画に局在するMaLionを発現させた原虫の構築を試みる。
MaLion原虫を作成し、様々な炭素源を用いて各細胞区画におけるATPを可視化し、ATP動態を解析する。また、原虫を分化させ個々の生活環ステージ原虫におけるATP動態も解析する。
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[Journal Article] The ASCT/SCS cycle fuels mitochondrial ATP and acetate production in Trypanosoma brucei.2020
Author(s)
Mochizuki K, Inaoka DK, Mazet M, Shiba T, Fukuda K, Kurasawa H, Millerioux Y, Boshart M, Balogun EO, Harada S, Hirayama K, Bringaud F, Kita K.
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Journal Title
Biochim Biophys Acta Bioenerg
Volume: 1861(11)
Pages: 148283(1-12)
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Structural and Biochemical Features of Eimeria tenella Dihydroorotate Dehydrogenase, a Potential Drug Target2020
Author(s)
Sato D, Hartuti ED, Inaoka DK, Sakura T, Amalia E, Nagahama M, Yoshioka Y, Tsuji N, Nozaki T, Kita K, Harada S, Matsubayashi M, Shiba T.
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Journal Title
Genes (Basel)
Volume: 11(12)
Pages: 1468(1-18)
DOI
Peer Reviewed / Open Access
