2020 Fiscal Year Research-status Report
クレブシエラ菌の腸内定着阻害に関わる腸内細菌の同定
| Project/Area Number |
19K07544
|
|---|
| Research Institution | Keio University |
|---|
Principal Investigator |
新 幸二 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 准教授 (60546787)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | 腸内細菌 / クレブシエラ |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
これまでの研究において、口腔由来のクレブシエラ菌（プロテオバクテリア門に属する細菌のひとつ）が腸内に定着すると大腸で強いTh1細胞の活性化を引き起こすこと、活性化したTh1細胞が炎症の惹起・増悪に働くことを明らかにした。また、クレブシエラ菌の腸内への定着は腸内細菌が阻害・抑制しており、過度な炎症が起こらないように制御されていることを見出している。しかしながら、どのような腸内細菌種がクレブシエラ菌の定着阻害に関与しているのか、どのような分子メカニズムでクレブシエラ菌の腸内定着を抑えているかについては明らかになっていない。そこで本研究では、ヒト由来腸内細菌の内、クレブシエラ菌の腸内への定着を阻害している腸内細菌種を同定し、その阻害メカニズムを明らかにすることを目的として、研究を行った。
ヒト健常者由来の腸内細菌のうちクレブシエラ菌を排除する細菌種を探索するため、健常者5人の便サンプルを用いてスクリーニングを行った。5人すべての便サンプル投与によりクレブシエラ菌の腸内からの排除が確認でき、さらに細菌種を絞り込むため腸内細菌種を単離培養し、再度解析を行った。その結果F便由来の37菌株が最も強力にクレブシエラ菌の排除を行うことが明らかになった。そこで、この37菌株からさらに細菌種を絞り込むため、抗菌薬であるアンピシリン投与後のクレブシエラ菌の挙動と37菌株の挙動を相関解析により検討を行った。その結果、有意にクレブシエラ菌と逆相関する細菌種が18株特定でき、さらに18株のみでクレブシエラ菌の腸内からの排除を行うことが検証できた。以上のことから、ヒト腸内細菌種のうち18種類の細菌がクレブシエラ菌の腸内からの排除に寄与していることが明らかになり、今後排除メカニズムの解析を行う予定である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヒト単離腸内細菌株を用いてクレブシエラ菌を腸内から排除できる細菌株のスクリーニングを行った。F, K, Iの3人の健常者から37株、68株、43株を単離し、それぞれの菌株混合液をクレブシエラ単独定着マウスに投与したところ、F37菌株、K68菌株を投与した場合にはクレブシエラが1-2週間で迅速に腸内から排除された。クレブシエラ菌単独定着マウスの便中クレブシエラ量は10^9-10^10 CFU/gであるが、1週間後に10^6 CFU/g 、2週間後に10^5 CFU/g程度にまで下がり、そのまま最低でも4週間抑えられた状態で維持された。一方でI43株は投与4週間後でも10^7 CFU/g程度までしかクレブシエラ菌が排除できず、F37およびK68株と比較してクレブシエラ排除能が低かった。次にF37菌株からクレブシエラ菌の排除を行う細菌株を絞り込むため、抗菌薬によるセレクションを行った。クレブシエラ単独定着マウスにF37菌株を投与し、アンピシリンを投与したところ、クレブシエラ菌の腸内からの排除が抑制された。さらに、F37菌株を投与した後2週間にアンピシリンを投与および投与中止した場合、クレブシエラ菌は一時的に上昇し再度下降した。そこで、このクレブシエラ菌の上下と逆相関している細菌株を探索したところ18菌株が有意に相関していた。そこで次にこの18菌株のみでクレブシエラ菌を排除できるかを検証したところ、F便およびF37株と同様に強力にクレブシエラ菌を腸内から排除できた。さらに37菌株から18菌株を除いた19菌株は排除能が弱く、18菌株と19菌株を比較することでクレブシエラ菌の排除メカニズムの探索を行う予定である。
|
| Strategy for Future Research Activity |
1.腸内細菌によるcolonization resistanceの実行因子の同定と分子機構の解明
今年度の実験で明らかになったcolonization resistanceの実行細菌F18菌株とクレブシエラ菌の排除が弱かったF37-18菌株を定着させたマウスの腸内容物を単離し、トランスクリプトームおよびメタボローム解析を行う。トランスクリプトーム解析にはゲノム情報が必要なので、すべての細菌株のゲノム配列を解読する。メタボローム解析はGC/MSとLC/MSを用いて短鎖脂肪酸、胆汁酸、アミノ酸代謝物などの腸内細菌がこれまで産生することが知られている代謝物を中心に解析を行う。トランスクリプトームとメタボローム解析を統合し、どのような遺伝子、どのような代謝物がcolonization resistanceに関与しているのか推測する。もし、候補代謝物が入手可能な場合はin vivo, in vitroでクレブシエラ菌の排除、増殖抑制・殺菌ができるかを検証する。入手できない場合は候補遺伝子の欠損株を作成し、候補代謝物の減少とともにクレブシエラ菌の排除が弱くなることを検証する。
2. 炎症性腸疾患モデルでの有用性の検討（2021年度）
IL-10欠損マウスにクレブシエラ菌を定着させると重篤な腸炎を発症する。このモデルを用いて、F18菌による炎症抑制効果を検証する。また同時にヒトの炎症性腸疾患患者の腸内でも同様のメカニズムが働いているかを検証するため、メタゲノムデータを用いて、F18菌株量およびcolonization resistanceに関与する遺伝子がクレブシエラ菌の存在量と逆相関するかを解析する。
|
| Causes of Carryover |
今年度は新型コロナの影響もあり、予定よりも実験量を削減したため当初の予定から余剰分が発生した。余剰分は次年度に無菌マウス購入および次世代シークエンサー解析代に当てる計画である。
|
Research Products
(1 results)
